Unul dintre cei mai importanți factori în succesul secvențierii automate a ADN-ului este proiectarea corectă a primerilor. Acest document descrie pașii implicați în acest proces și principalele capcane care trebuie evitate.
**** Use a Computer to Design Primers ****
Recomandăm cu tărie utilizarea unui computer în timpul proiectării amorselor pentru a verifica anumite defecte fatale de proiectare. Numeroase programe sunt capabile să efectueze această analiză. De exemplu, căutați „Primer3” pe internet.
Câteva concepte de bază: Dacă sunteți confuzi în privința șirurilor și a orientării amorselor, citiți acest lucru.
Amorsorii de secvențiere trebuie să fie capabili să se aneantizeze la ADN-ul țintă într-un loc previzibil și pe un șir previzibil. În plus, ei trebuie să fie capabili de extensie de către Taq ADN polimeraza.
Câteva persoane sunt confuze cu privire la modul de examinare a unei secvențe de ADN pentru a alege o secvență de amorsă adecvată. Iată câteva lucruri pe care novicii trebuie să le rețină:
- Secvențele sunt întotdeauna scrise de la 5′ la 3′. Aceasta include secvența ADN-ului șablon (dacă este cunoscută), secvența ADN-ului vector în care este inserat și secvența amorselor propuse. Nu scrieți niciodată o secvență de amorsă inversată sau nu veți face decât să vă confundați pe voi înșivă și pe ceilalți.
- Polimeraza prelungește întotdeauna capătul 3′ al amorsă, iar secvența pe care o veți citi va fi aceeași catenă (sens sau antisens) ca și amorsa însăși.
- Astfel, dacă alegeți o secvență de amorsă pe care o puteți citi în secvența sursă (de exemplu, în vector), secvența pe care o veți obține se va prelungi de la capătul drept (3′) al amorsăi.
- Conversa, dacă alegeți o amorsă de pe filamentul opus celui pe care îl citește secvența „sursă”, secvența rezultată se va citi spre stânga.
Iată câteva exemple:
Să presupunem că aveți un vector cu următoarea secvență în jurul situsului de clonare multiplă („MCS”):
TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI
Dacă ați clonat ADN-ul care vă interesează între situsurile BamHI și EcoRI, ați putea secvenția cu ajutorul primerului „CTTGATGCTAGTACTACATC” (nu uitați – se scrie de la 5′ la 3′) și veți obține următoarea secvență din nucleu:
TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)
Dacă, în schimb, doriți o secvență de pe celălalt filament – de la Eco la Bam? În acest caz, trebuie să selectați o secvență din dreapta și apoi să o completați invers înainte de a solicita oligo. Selectarea unei secvențe din figura de mai sus:
CTGATGCTCATATGTTAATA
Aceasta NU este secvența de amorsare – este copiată textual din secvența de mai sus. De fapt, dacă ați folosi această secvență pentru un primer, secvențierea ar continua spre dreapta, departe de inserția dvs. În schimb, completați invers această secvență:
TATTAACATATGAGCATCAG
Acum aceasta ar trebui să producă secvența de pe filiera opusă:
CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)
Câteva litere mici: Doar rareori secvențierea arată de fapt nucleotidele aflate imediat în aval de amorsă. Mi-am luat o anumită licență didactică în exemplele de mai sus.
Concepte mai avansate: How to Design a Primer that Works.
În general, începeți cu o cantitate mică de secvență cunoscută pe care doriți să o extindeți. Iată cum să procedați:
I. Proiectați amorsele numai pornind de la date precise de secvență. Secvențierea automatizată (și, de fapt, orice secvențiere) are o probabilitate finită de a produce erori. Secvența obținută prea departe de amorsă trebuie să fie considerată discutabilă. Pentru a determina ce este „prea departe”, sugerăm cu insistență clienților noștri să citească memoriul Interpretation of Sequencing Chromatograms (Interpretarea cromatogramelor de secvențiere), care descrie modul de evaluare a validității datelor obținute cu ajutorul secvențiatoarelor ABI. Selectați o regiune pentru plasarea amorselor în care posibilitatea de eroare de secvență este redusă. II. Limitați-vă căutarea la regiunile care reflectă cel mai bine obiectivele dumneavoastră.
Poate fi interesat să maximizați datele de secvență obținute, sau poate că aveți nevoie să examinați secvența doar într-o locație foarte specifică din șablon. Astfel de nevoi dictează poziționări foarte diferite ale amorselor.
- Maximizați secvența obținută, minimizând în același timp potențialul de erori:
În general, ar trebui să proiectați amorsa cât mai departe de 3′, atât timp cât aveți încredere în acuratețea secvenței din care este extrasă amorsa. Amorsele de pe șiruri opuse ar trebui să fie plasate în mod eșalonat pe cât posibil. - Secvențierea țintită a unei regiuni specifice:
Posiționați amorsa astfel încât secvența dorită să cadă în cea mai precisă regiune a cromatogramei. Datele de secvență sunt adesea cele mai precise la o distanță de aproximativ 80-150 de nucleotide față de amorsă. Nu vă bazați pe faptul că veți vedea o secvență bună la mai puțin de 50 de nucleotide distanță de amorsă sau la mai mult de 300 nt (deși adesea obținem secvențe care încep imediat după amorsă și adesea returnăm 700 nt de secvență precisă).
III. Localizați amorsele candidate:
Identificați potențiali amorse de secvențiere care produc o împerechere stabilă a bazelor cu ADN-ul șablon în condiții adecvate pentru ciclul de secvențiere. Se sugerează cu insistență să folosiți un calculator la această etapă. Caracteristici sugerate pentru amorsă:
- Lungimea ar trebui să fie între 18 și 30 nt, cea optimă fiind de 20-25 nt. (Deși am avut unele succese cu amorsă mai lungă de 30 și mai scurtă de 18).
- Este de dorit un conținut de G-C de 40-60%.
- Tm-ul trebuie să fie între 55 C și 75 C. Atenție: vechea regulă „4 grade pentru fiecare G-C, 2 grade pentru fiecare A-T” funcționează prost, în special pentru oligo mai scurt de 20 sau mai lung de 25 nt. În schimb, încercați:
Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)
Există un calculator Tm pe internet pe care îl puteți încerca la http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.
IV. Eliminați amorsele candidate care prezintă o autohibridizare nedorită.
Primerii care se pot autohibridiza nu vor fi disponibili pentru hibridarea cu șablonul. În general, evitați amorsele care pot forma 4 sau mai multe legături consecutive cu el însuși, sau 8 sau mai multe legături în total. Exemplu de amorsă marginal problematică:
5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'
Acest oligo formează un dimer substanțial stabil cu el însuși, cu patru legături consecutive în două locuri și un total de opt legături între șiruri.
Primerii cu capetele 3′ care se hibridizează chiar și tranzitoriu se vor extinde datorită acțiunii polimerazei, ruinând astfel amorsa și generând benzi false. Fiți ceva mai riguroși în evitarea dimerilor 3′. De exemplu, următorul primer se auto-dimerizează cu o hibridizare 3′ perfectă pe el însuși:
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
Oligo de mai sus este destul de rău și aproape garantat că va cauza probleme. Rețineți că polimeraza va extinde capătul 3′ în timpul reacției de secvențiere, dând o secvență foarte puternică ACTATGC. Aceste benzi vor apărea la începutul datelor dvs. „reale” ca vârfuri imense, ocluzând secvența corectă. Cele mai multe programe de proiectare a amorselor vor depista corect astfel de amorsă care se autodimerizează și vă vor avertiza să le evitați.
Rețineți totuși că niciun program de calculator sau evaluare de tip regulă degetul mare nu poate prezice cu exactitate succesul sau eșecul unei amorsă. Un primer care pare marginal poate avea performanțe bune, în timp ce un altul care pare fără cusur poate să nu funcționeze deloc. Evitați problemele evidente, proiectați cei mai buni amorsori pe care îi puteți proiecta, dar în caz de urgență, dacă aveți puține opțiuni, încercați doar câțiva amorsori candidați, indiferent de potențialele defecte.
V. Verificați specificitatea de situs a amorsorului. Efectuați o căutare a homologiei secvenței (de exemplu, compararea homologiei dot-plot) prin toate secvențele cunoscute ale șablonului pentru a verifica dacă există situsuri alternative de amorsare. Eliminați orice amorsă care prezintă o tendință „semnificativă” de a se lega la astfel de situsuri. Putem oferi doar indicații aproximative cu privire la ceea ce este „semnificativ”. Evitați primerii care prezintă situsuri alternative cu (1) o homologie mai mare de 90 % față de situsul primar sau (2) mai mult de 7 nucleotide omoloage consecutive la capătul 3′ sau (3) o abundență mai mare de 5 ori mai mare decât situsul de amorsare prevăzut. VI. Alegerea între primeri candidați.
Dacă în acest moment aveți mai mulți amors candidați, puteți selecta unul sau câțiva care sunt mai bogați în A-T la capătul 3′. Aceștia tind să fie ușor mai specifici în acțiune, conform unor cercetători. Este posibil să doriți să utilizați mai mult de un primer, pentru a maximiza probabilitatea de succes.
Dacă nu aveți niciun candidat care să supraviețuiască criteriilor de mai sus, atunci s-ar putea să fiți obligat să relaxați strictețea cerințelor de selecție. În cele din urmă, testul unui primer bun este doar în utilizarea sa și nu poate fi prezis cu exactitate prin aceste reguli simpliste de degetul mare.
Cu noroc, totuși, aveți o mulțime de opțiuni pentru primeri. Pentru un proiect de asamblare a unei secvențe, proiectați mai mulți amorsori decât credeți că aveți cu adevărat nevoie, astfel încât, dacă secvența nu este atât de lungă pe cât ați sperat, să puteți obține totuși suficiente date suprapuse pentru a vă asigura un consens bun al secvenței. Vă recomandăm să secvențiați ambele catene, pentru o mai bună confirmare. Pe o filieră, spațiați primerii la o distanță de 500 până la 700 nt (o spațiere mai scurtă este mai sigură!). Pe filiera opusă, amplasați primerii în mod eșalonat, la distanță de primerii de pe prima filieră, așa cum este ilustrat mai jos:
