Jednym z najważniejszych czynników udanego zautomatyzowanego sekwencjonowania DNA jest prawidłowe zaprojektowanie starterów. Ten dokument opisuje kroki związane z tym procesem i główne pułapki, których należy unikać.
**** Use a Computer to Design Primers ****
Bardzo zalecamy, aby podczas projektowania starterów używać komputera w celu sprawdzenia pewnych fatalnych błędów projektowych. Liczne programy są zdolne do przeprowadzenia takiej analizy. Na przykład, poszukaj 'Primer3′ w sieci.
Kilka podstawowych pojęć: Jeśli jesteś zdezorientowany przez pasma i orientację primera, przeczytaj to.
Sequencing primers must be able to anneal to the target DNA in a predictable location and on a predictable strand. Ponadto muszą być zdolne do rozszerzenia przez polimerazę Taq DNA.
Niektórzy ludzie są zdezorientowani co do tego jak zbadać sekwencję DNA aby wybrać odpowiednią sekwencję primera. Oto kilka rzeczy do zapamiętania dla nowicjuszy:
- Sekwencje są zawsze zapisywane od 5′ do 3′. Obejmuje to sekwencję twojego szablonowego DNA (jeśli jest znana), sekwencję DNA wektora, do którego jest wstawiany, oraz sekwencję proponowanych primerów. Nigdy nie pisz sekwencji primera odwrotnie, albo tylko zdezorientujesz siebie i innych.
- Polimeraza zawsze wydłuża 3′ koniec primera, a sekwencja, którą odczytasz będzie tą samą nicią (sens lub antysens) co sam primer.
- Tak więc, jeśli wybierzesz sekwencję primera, którą możesz odczytać w swojej sekwencji źródłowej (na przykład w wektorze), sekwencja, którą uzyskasz będzie się rozciągać od prawego (3′) końca primera.
- I odwrotnie, jeśli wybierzesz primer z nici przeciwnej do tej, którą odczytuje twoja sekwencja „źródłowa”, wynikowa sekwencja będzie odczytywana w lewo.
Oto kilka przykładów:
Załóżmy, że masz wektor z następującą sekwencją wokół miejsca wielokrotnego klonowania („MCS”):
TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI
Jeśli sklonowałeś swoje DNA pomiędzy miejscami BamHI i EcoRI, możesz sekwencjonować używając primera 'CTTGATGCTAGTACTACATC’ (pamiętaj – to jest zapisane od 5′ do 3′) i otrzymasz następującą sekwencję z rdzenia:
TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)
A co, jeśli chciałbyś sekwencję z drugiej strony – od Eco do Bam – zamiast tego? W takim przypadku należy wybrać sekwencję po prawej stronie, a następnie dokonać jej odwrotnej komplementacji przed zamówieniem oligo. Wybieranie sekwencji z powyższego rysunku:
CTGATGCTCATATGTTAATA
To NIE jest sekwencja primera – jest ona skopiowana dosłownie z powyższej sekwencji. W rzeczywistości, gdybyś użył tej sekwencji jako primera, sekwencjonowanie przebiegałoby w prawo, z dala od wstawki. Zamiast tego, wykonaj komplementację odwrotną tej sekwencji:
TATTAACATATGAGCATCAG
Następnie powinna powstać sekwencja przeciwnej nici:
CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)
Trochę drobnego druku: Tylko rzadko sekwencjonowanie faktycznie pokazuje nukleotydy bezpośrednio za starterem. W powyższych przykładach zastosowałem pewną dydaktyczną licencję.
Więcej zaawansowanych koncepcji: How to Design a Primer that Works.
Generalnie, zaczynasz z niewielką ilością znanej sekwencji, którą chcesz przedłużyć. Oto jak należy postępować:
I. Projektuj primery tylko z dokładnych danych sekwencji. Automatyczne sekwencjonowanie (a w zasadzie każde sekwencjonowanie) ma skończone prawdopodobieństwo produkowania błędów. Sekwencja uzyskana zbyt daleko od startera musi być uznana za wątpliwą. Aby określić, co jest „za daleko”, zdecydowanie sugerujemy naszym klientom przeczytanie notatki Interpretation of Sequencing Chromatograms, która opisuje, jak ocenić poprawność danych uzyskanych z sekwenatorów ABI. Wybierz region do umieszczenia primera, w którym prawdopodobieństwo wystąpienia błędu sekwencji jest niskie. II. Ogranicz swoje poszukiwania do regionów, które najlepiej odzwierciedlają Twoje cele.
Możesz być zainteresowany maksymalizacją uzyskanych danych sekwencyjnych, lub możesz potrzebować zbadać sekwencję tylko w bardzo specyficznym miejscu w szablonie. Takie potrzeby dyktują bardzo różne umiejscowienia primerów.
- Maksymalizacja uzyskanej sekwencji przy minimalizacji potencjału błędów:
Ogólnie, powinieneś zaprojektować primer tak daleko do 3′ jak tylko możesz, tak długo jak masz zaufanie do dokładności sekwencji, z której primer jest pobierany. Startery na przeciwnych pasmach powinny być umieszczone w sposób rozłożony w czasie tak bardzo jak to możliwe. - Sekwencjonowanie ukierunkowane określonego regionu:
Umieścić starter tak, aby pożądana sekwencja wypadała w najbardziej dokładnym regionie chromatogramu. Dane sekwencji są często najdokładniejsze w odległości około 80-150 nukleotydów od startera. Nie należy liczyć na dobrą sekwencję w odległości mniejszej niż 50 nukleotydów od primera lub większej niż 300 nt (chociaż często uzyskujemy sekwencję zaczynającą się zaraz po primerze, i często zwracamy 700 nt dokładnej sekwencji).
III. Zlokalizowanie starterów kandydujących:
Zidentyfikuj potencjalne startery sekwencjonujące, które wytwarzają stabilne parowanie zasad z szablonowym DNA w warunkach odpowiednich do sekwencjonowania cyklicznego. Na tym etapie zdecydowanie zaleca się korzystanie z komputera. Sugerowane charakterystyki starterów:
- Długość powinna być pomiędzy 18 a 30 nt, z optymalną 20-25 nt. (Chociaż mieliśmy pewne sukcesy ze starterami dłuższymi niż 30 i krótszymi niż 18).
- Zawartość G-C 40-60% jest pożądana.
- Tm powinno być pomiędzy 55 C a 75 C. Ostrzeżenie: stara zasada „4 stopnie dla każdego G-C, 2 stopnie dla każdego A-T” działa słabo, szczególnie dla oligosów krótszych niż 20 lub dłuższych niż 25 nt. Zamiast tego, spróbuj:
Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)
Istnieje internetowy kalkulator Tm, który możesz wypróbować pod adresem http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.
IV. Odrzuć startery kandydujące, które wykazują niepożądaną samohybrydyzację.
Prymery, które mogą ulegać samohybrydyzacji będą niedostępne do hybrydyzacji z szablonem. Generalnie unikaj primerów, które mogą tworzyć 4 lub więcej kolejnych wiązań z samym sobą, lub 8 lub więcej wiązań ogółem. Przykład marginalnie problematycznego primera:
5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'
Ten oligo tworzy zasadniczo stabilny dimer z samym sobą, z czterema kolejnymi wiązaniami w dwóch miejscach i w sumie ośmioma wiązaniami międzywłóknowymi.
Primery z 3′ końcami hybrydyzującymi nawet przejściowo staną się wydłużone z powodu działania polimerazy, rujnując w ten sposób primer i generując fałszywe pasma. Bądź nieco bardziej rygorystyczny w unikaniu 3′ dimerów. Na przykład, następujący primer samodimeryzuje się z doskonałą hybrydyzacją 3′ na sobie:
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
Powyższe oligo jest całkiem złe i prawie gwarantowane, że spowoduje problemy. Zauważ, że polimeraza przedłuży 3′ koniec podczas reakcji sekwencjonowania, dając bardzo silną sekwencję ACTATGC. Te pasma pojawią się na początku Twoich „prawdziwych” danych jako ogromne piki, zasłaniając prawidłową sekwencję. Większość programów do projektowania primerów prawidłowo wykryje takie samodimeryzujące się primery i ostrzeże, aby ich unikać.
Zauważ jednak, że żaden program komputerowy lub ocena na zasadzie kciuka nie może dokładnie przewidzieć sukcesu lub porażki primera. Podkład, który wydaje się marginalne może wykonywać dobrze, podczas gdy inny, który wydaje się być bez zarzutu może nie działać w ogóle. Unikaj oczywistych problemów, projektuj najlepsze startery, jakie możesz, ale w razie potrzeby, jeśli masz niewiele opcji, po prostu spróbuj kilku kandydatów na startery, niezależnie od potencjalnych wad.
V. Zweryfikuj specyficzność miejsca startera. Wykonaj wyszukiwanie homologii sekwencji (np. porównanie homologii dot-plot) we wszystkich znanych sekwencjach szablonu, aby sprawdzić alternatywne miejsca primingu. Odrzucić wszystkie primery, które wykazują „znaczącą” tendencję do wiązania się z takimi miejscami. Możemy podać tylko przybliżone wytyczne co do tego, co jest „znaczące”. Unikać primerów, w których obecne są alternatywne miejsca z (1) ponad 90% homologią do miejsca pierwotnego lub (2) więcej niż 7 kolejnych homologicznych nukleotydów na końcu 3′ lub (3) obfitością większą niż 5-krotnie większą niż zamierzone miejsce primingu. VI. Wybór między starterami kandydującymi.
Jeśli w tym momencie masz kilka kandydujących starterów, możesz wybrać jeden lub kilka, które są bardziej bogate w A-T na 3′ końcu. Te mają tendencję do bycia nieco bardziej specyficznymi w działaniu, według niektórych badaczy. Możesz chcieć użyć więcej niż jednego primera, maksymalizując prawdopodobieństwo sukcesu.
Jeśli nie masz kandydatów, którzy przetrwali powyższe kryteria, to możesz być zmuszony do rozluźnienia surowości wymagań selekcji. Ostatecznie, test dobrego primera jest tylko w jego użyciu, i nie może być dokładnie przewidziana przez te uproszczone zasady-of-thumb.
Przy odrobinie szczęścia, chociaż, masz wiele opcji dla primerów. Dla projektu składania sekwencji, zaprojektuj więcej starterów niż myślisz, że naprawdę potrzebujesz, tak, że jeśli sekwencja nie jest tak długa jak miałeś nadzieję, nadal możesz uzyskać wystarczającą ilość nakładających się danych, aby zapewnić sobie dobry konsensus sekwencji. Zalecamy sekwencjonowanie obu nici, dla lepszego potwierdzenia. Na jednej nici należy umieścić startery w odstępach 500 do 700 nt (mniejsze odstępy są bezpieczniejsze!). Na przeciwległej nici, umieścić startery w odstępach od starterów pierwszej nici, jak pokazano poniżej:
