PMC

DNEs IN TRANSCRIPTIONAL REGULATION

DNE は転写制御の文脈でも発生することがあります。 例えば、モジュール型TFの転写活性化ドメインを除去し、DNA結合ドメインのみを残すことでDNEを得ることができる。 この切断された因子は転写の競合的阻害剤として振る舞うことができる。 これは自然界でも起こることが知られている。 例えば、哺乳類のC/EBPタンパク質は、3つの代替ポリペプチドとして発現している。 長い方のポリペプチドはN末端に転写活性化ドメインを持ち、短い方のポリペプチドはそれを持たない。 長いアイソフォームと短いアイソフォームはホモおよびヘテロダイマーに集合するので、後者は天然のDNとして振る舞う (Zahnow et al., 1997)。 これは脊椎動物のStats 5と6も同様で、二量体化することが可能である。 生理的なシグナルに応答してタンパク質分解が起こると、C末端の活性化ドメインが除去され、シグナル伝達を負に制御する強力な阻害剤に変わる (Nakajima et al., 2003)。 植物では、多くのMYBタンパク質が転写調節因子として機能している。 シロイヌナズナでは、MYB DNA結合リピートを1つ持ち、転写活性化ドメインを持たないタンパク質が、表皮細胞の運命決定に関与している。 これらのタンパク質はbHLHタンパク質を含む他のTFと相互作用し、トランス活性化ドメインがないために、不活性な複合体を形成してDNおよびtrans-DNとして振る舞う（Ramsay and Glover, 2005）。 これはbHLH TFsで起こる。 上述したように、Id-1遺伝子はこのファミリーのTFの天然に存在するDNインヒビターをコードしている。 完全なbHLHタンパク質（DNA結合ドメインと二量体化ドメインを持つ）は構成的に発現させることができる。 しかし、二量体化ドメインのみを含むId-1の発現が制御されることにより、bHLHタンパク質の活性が制御される(Sun, 1994)。 植物においても同様の現象が予想される。 例えば、シロイヌナズナのゲノムには、DNAと結合すると予測される約120種類のbHLHタンパク質と、結合に必要な塩基性領域が少ない27種類のタンパク質がコードされている（Toledo-Ortiz et al.、2003）。 これらのDNAと結合しないHLHは、動物のIdタンパク質のように、DNAと結合できないヘテロダイマーを形成してbHLHタンパク質のネガティブレギュレーターとして機能しているのかもしれない（Toledo-Ortiz et al, 2003）。 基本DNA結合モチーフ、ロイシンジッパー二量体化ドメイン、転写用ドメインを持つbZIP（basic domain/leucine zipper）ファミリーに属するTFでも同様の効果が期待される。 シロイヌナズナには67個のbZIPタンパク質がコードされており、そのすべてがホモおよび/またはヘテロダイマーとして機能することが予測されている(Deppmann et al., 2004)。 これらの中には、非常に小さく、活性化ドメインがないものもある。 植物における典型的な例として、Fukazawaら（2000）は、bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH（RSG）のジベレリン情報伝達における機能を、転写活性化ドメインを持たないDN型のRSGを用いて明らかにし、その結果、遺伝子組み換えタバコで発現すると野生型タンパク質の機能を抑制する働きをすることが明らかにされた。 さらに、過剰発現によるトランスDNの項で述べたように、DNA-タンパク質転写複合体は、遺伝子量のバランスにも敏感である（Birchlerら、2001; Veitia、2002）。 ある転写因子と他の転写因子との発現量の差によってこのバランスが変化すると、異常な表現型が引き起こされる。 ウイルス系やショウジョウバエの研究から、転写はしばしば転写因子の濃度に対してシグモイドの関係を示すことが分かっている。 一種類の活性化因子（A）に反応する系の場合、このシグモイド反応は、標的遺伝子のプロモーター（p）へのAの協調的結合と相乗効果の二つの主要な要素に分解することができる（図6）。 相乗効果は、すでにプロモーターに結合しているAの分子と転写機構との間の協調的相互作用の結果である(Carey, 1998; Veitia, 2003)。

Aに対する2つの結合部位を含むプロモーターpを考える。同じ結合部位は、競合阻害剤として働くかもしれない変異体aによっても認識される。 A分子とプロモーターの相互作用の間に協力性があると仮定する。 これは、A、a、プロモーターの間の相互作用についても同様であろう。 協力性の源泉の1つとして、先に述べたようなことが考えられる（すなわち、Aは溶液中で2量体を形成する傾向があるが、DNA結合時にはそれが増強される）。 もう一つの可能性は、単量体が溶液中で相互作用できず、ある単量体がDNAと相互作用することによってアロステリックな変化が起こり、結合したAの入ってくる単量体への親和性が高まることである。 また、可能性は低いが、A-A相互作用がなく、あるモノマーがDNAに結合すると、隣接する部位に変化が起こり、新しく入ってくるモノマーに対する親和性が高まるという可能性もある。

相乗効果の存在により、転写に最も寄与する分子種は、2分子の活性化因子：pAAによって占有されるプロモーターである。 これはまた、複合体pAとポリメラーゼの会合に対する親和定数をKpolAとすると、pAAとポリメラーゼの会合に対するKは2Kよりはるかに高くなる（K2polAのオーダー；Zlotnick, 1994参照）ことを意味している。 このモデルで部分的な転写活性を考慮するために、Kpola (反応pa + pol)とKpola2 (反応paa + pol)を用いることにする。 これらの仮定の下で、A（およびa）の濃度の関数としての転写反応（TR）の方程式は、Veitia（2003）およびVeitia and Nijhout（2006）により記述されているように導き出すことができる（オンラインの補足資料を参照）

かなり単純な方程式を手にして、いくつかの条件を探ることが可能である。 (1)野生型であるA/A、(2)対立遺伝子が欠損しているA/-、(3)Aと転写活性化ドメインを欠く切断型aが共発現している場合である。 後者の場合、2つの異なる状況を区別することができる。 後者の場合、(3a)aの変異により協調性が失われる場合と、(3b)Aとaが協調的に作用する場合とに分けられる。 最後に、aの転写能が正常で協同性がない場合（4）と、協同性は正常だが転写能が部分的な場合（5）を探ることができる。

図7は、プロモーターの最大出力に対するa TRが0から1までのシグモイドの関係を示している。 図によると、一般に、どの点においてもヘテロ接合体A/-の曲線上の値はA/Aよりも低い（相対値の各値について、ヘテロ接合体A/-は野生型よりも絶対値で2倍少ない）。 興味深いことに、Aの相対濃度が低い場合、曲線間のシフトは非常に顕著であり、Y(A/-)はY(A/A)の約25%になる。 しかし、直感的に予想されるように、高濃度のAでは、A/-でも飽和に達する。 もしこのシステムが低濃度のAで正常に機能するならば、A/-の個体は典型的なハプロインスフィシェントの表現型を示すだろう。

A/aでaが協調性のない状態で転写活性化ドメインを欠くとどうなるのだろうか？ 古典的なDNの定義によれば、曲線はA/-の場合よりもどの点でも低くなる。 しかし、Aやaの濃度が高くなると飽和状態になる傾向がある。実際、Aは入ってくるAモノマーとの協同的な相互作用を確実にするため、優先的にプロモーターを占有する傾向がある。 しかし、低タンパク質濃度でのプロモーター認識は、A/aでは野生型条件よりも起こりにくいことが明らかである。 実際には、協力的な相互作用を確保できない切断されたモノマーは、弱いDNEをもたらすことになる。 もう一方の極である、Aとaの間の協同性が完全に保たれている場合には、状況は全く異なる。 実際、A/aの曲線のプラトーはTR = 0.25で到達している。 これは転写を駆動する（すなわちpAaとpaaの寄与は無視できる）pAAが、飽和状態で占有されたプロモーター種の25％しか表さないことから予想される。

潜在的な例は、TF FOXL2の人工突然変異によって提供される。 このTFは、複数の推定結合部位を含むヒトステロイドジェニック急性調節遺伝子のプロモーターを抑制する。 DNA結合ドメインを含み、C末端ドメインを欠いたFOXL2は、転写抑制を損なうDNEを誘発することが可能である。 しかし、この効果は、DNバージョンが野生型タンパク質よりもはるかに強く（5倍および10倍）発現している場合にのみ得られる（Pisarskaら、2004年）。 上に概説したように、これは、このプロモーター上でのFOXL2分子間の協力的相互作用がないためであると考えられる。

よりよくわかる例が図8に示されており、これは、先に述べたように、TF PTX2aおよびそのDNバージョンに対する1または2の結合部位を含む2つの異なるプロモーターの応答を表す（Saadiら、2003. 低い量のトランスフェクションDNA（図8では0.05μg）において、2つの部位を有するプロモーターの応答は、1つの部位のみを有するプロモーターの応答よりも2倍以上（すなわち、3×）強い。 これは、協調性と相乗効果の複合的なサインである。 さらに、WT+DNを高濃度で導入した場合、2つの結合部位を持つプロモーターのTRは、野生型単独の応答の約25%であった。 これは、高タンパク質濃度では、標的DNAに到達する前に二量体が形成されるためと考えられる。 この場合、正常な二量体は25%に過ぎない。 結合部位が1つしかないプロモーターの場合、TRの低下はそれほど劇的ではない（予想される50％）。 実用的な観点からは、in vitro実験において潜在的なDNEを見落とさないために、少量のWT+DN構築物を過剰なレポータープロモーターでトランスフェクトして、野生型フォームによる飽和を避ける必要がある。 より一般的には、異なるTF濃度に対する応答曲線が、そのようなトランスフェクション実験のために提供されるべきである。

直感的に予想されるように、aの転写能力が正常で協同性がない場合、非常に穏やかなDNEが現れ、ヘテロ接合状態においてヌル対立遺伝子に近い挙動に至る。 この種の変異体の単離は、Burz and Hanes (2001)によって報告されたエレガントな酵母遺伝学的スクリーニングを用いることで可能である。 突然変異は、協力性のレベルにはそれほど劇的な影響を与えないこともあります。 興味深いケースは、協同性が正常なレベルのおよそ10分の1まで低下し（図7に示された結果の基礎となるパラメータによる）、転写能が正常である場合に生じる。 このような条件では、変異体aはホモ接合体a/aではhypomorphic alleleとして、A/aではnull alleleとして振る舞う（すなわち、A/a = A/-；データは示されていない）。

トランスアクティベーションが残存し（すなわち1<Kpola<KpolA），協同性が正常な場合，A/aのプラトーはTR=1には達しないが，より低いレベルにある． 場合によっては部分的な活性化能を持つ対立遺伝子が容易に作製できる。 そのパラダイムは酵母のTF Gal4に提供されている。Gal4は転写装置のリクルートに関与する2つの活性化領域（ARIとARII）を持っている。 酸性領域ARIIの欠失は、転写活性化能の低下をもたらす（Ptashne and Gann, 2002; Ptashne, 2007）。 このような対立遺伝子と野生型Gal4との組み合わせは、前述のような挙動を示すはずである。 図7に示すように、A/aの曲線はA/-の曲線と交差している。 このように、同じ対立遺伝子でも、飽和レベルが低い場合（曲線が交差する前）にはhypomorphicとなり、タンパク質濃度が高くなると分子的にDNとなることがある。 直感的な説明が可能である。 例えば、ポリメラーゼと相互作用するタンパク質aが、例えば、野生型の90％の強度で相互作用するとする。 ある範囲の濃度では、ヘテロ接合体A/aはA/Aのようにふるまう傾向がある。 しかし、飽和状態ではプロモーター種の25%だけがpAAとなり、ポリメラーゼと最大限の強さで相互作用するようになる。 一方、ヘテロ接合体A/-では、低タンパク質濃度ではプロモーターを占有することが難しくなるが、飽和状態ではプロモーター種の100%がpAAとなる。 したがって、A/aとA/-の曲線はある時点で互いに交差しなければならない。

細胞内のすべての標的プロモーターが、DN TFに対して等しく感受性があるとは限らない。 強い協同性と相乗効果がある場合、DNタンパク質に対するプロモーターの感受性はDNA上の結合部位の数に依存するはずである。 転写を駆動するプロモーター種が、上記のように野生型タンパク質が完全に負荷されたものであると仮定すると、最大TRはオンラインの補足資料にある式（二項確率の）を使って計算することができる。 2つの同じ結合部位を持つプロモーターの場合、最大TRは野生型条件の出力に対して25%になる。3つの結合部位では12.5%、4つの結合部位では6.25%である（Aとaが等モル濃度で表現されている場合）。 より複雑な状況では、答えは直感的ではなく、ここで扱っていないモデルの解析が必要である

。