重要作物のサトウキビやトウモロコシ、その他熱帯地方に分布が拡大したと考えられる種など、特定の植物では、光呼吸をほとんど妨げない炭素固定という特殊な機構が発達しています。 これらの植物の葉は、特殊な解剖学的・生化学的構造を持っている。 特に、光合成の機能が中葉と束鞘の葉の細胞に分担されている。 炭素固定経路は、まず中葉細胞で二酸化炭素を重炭酸に変換し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼという酵素によって炭素3つの酸ホスホエノールピルビン酸（PEP）に付加する。 この反応の産物が炭素数4の酸であるオキサロ酢酸であり、C4経路の一形態として、同じく炭素数4の酸であるリンゴ酸に還元される。 そして、リンゴ酸は葉の維管束の近くにある束鞘細胞へと運ばれる。 そこでリンゴ酸は葉緑体に入り、リンゴ酸酵素によって酸化・脱炭酸（＝CO2を失う）される。 その結果、高濃度の二酸化炭素が得られ、束鞘細胞のカルビン-ベンソンサイクルに供給され、炭素3つの酸であるピルビン酸がメソフィル細胞へと戻されるのである。 葉緑体では、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（PPD）という酵素がATPとPiを使ってピルビン酸をPEPに戻し、C4サイクルを完成させる。 この経路は、生物種によっていくつかのバリエーションがある。 たとえば、いくつかの種では、アミノ酸のアスパラギン酸およびアラニンが、リンゴ酸およびピルビン酸の代わりになることがあります。
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C4経路は、束鞘細胞の葉緑体に高濃度の二酸化炭素を蓄積するメカニズムとして機能します。 その結果、これらの葉緑体の内部の二酸化炭素のレベルが高くなり、カルボキシル化と酸素化の比率を高め、光呼吸を最小限に抑える役割を果たします。 この機構を駆動するために植物は余分なエネルギーを消費するが、そのエネルギーロスを補って余りあるほど、光呼吸が発生しない条件下で、光呼吸をほぼゼロにすることができる。 サトウキビやその他の植物でこの経路を採用しているものは、すべての種の中で最も高い年間バイオマス収量を記録している。 光呼吸が重要でない冷涼な気候では、C4植物は希少である。
PEP carboxylaseは、葉緑体細胞に存在し、C4植物に必須の酵素である。 高温で乾燥した環境では、植物が葉からの水分損失を減らすために気孔を閉じたり、部分的に閉じたりすると、葉内部の二酸化炭素濃度が低下する。 このような環境では、二酸化炭素濃度が低いときにルビスコがRuBPに酸素を付加するため、ルビスコを主要なカルボキシル化酵素として用いる植物では、光呼吸が起こりやすいと考えられている。 しかし、PEPカルボキシラーゼは、酸素を基質とせず、ルビスコよりも二酸化炭素への親和性が高い。 そのため、葉の気孔が一部しか開いていないような、二酸化炭素が減少した状態でも二酸化炭素を固定できる能力を持っている。 その結果、光合成の速度が同じであれば、C4植物はC3植物に比べて水分の損失が少なくなる。 このため、C4植物は乾燥した温暖な環境に適しているのです
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