基本的な高速液体クロマトグラフィシステムのコンポーネントを図Eのシンプルな図に示します。 高圧ポンプは、指定された流量の移動相（通常は1分間に数ミリリットル）を生成して計量するために使用されます。 インジェクターは、サンプルをHPLCカラムに運ぶ連続的に流れる移動相の流れに導入することができます。 カラムには、分離に必要なクロマトグラフィ充填剤が含まれています。 この充填剤は、カラムのハードウェアによって固定されているため、固定相と呼ばれます。 HPLCカラムから溶出する分離化合物のバンドを確認するために、検出器が必要です。 移動相は検出器から排出され、必要に応じて廃棄または回収することができます。 移動相に分離した化合物のバンドが含まれる場合、HPLCでは、精製された化合物を含む溶出液の画分を回収して、さらに研究を進めることができます。 これは分取クロマトグラフィーと呼ばれます。
ポンプ、インジェクタ、カラム、および検出器を相互に接続して、移動相、サンプル、および分離した化合物バンドの導管を形成するために高圧チューブと継手が使用されていることに注意してください。
図E: 高速液体クロマトグラフィーシステム
検出器はコンピュータデータステーションに接続されており、HPLCシステムのコンポーネントとして、ディスプレイにクロマトグラムを表示し、サンプル成分の濃度を特定して定量化するために必要な電気シグナルを記録します（図Fを参照）。 試料化合物の特性は千差万別であるため、数種類の検出器が開発されています。 例えば、紫外線を吸収する化合物であれば、紫外線吸収型検出器が用いられる。 また、化合物が蛍光を発する場合は、蛍光検出器を使用する。 そのどちらもない場合は、蒸発光散乱検出器など、より汎用的な検出器が用いられる。 最も強力な方法は、複数の検出器を直列に使用することである。 例えば、UV検出器やELSD検出器と質量分析計を組み合わせて、クロマトグラフィー分離の結果を分析することができる。 これにより、1回の注入で、分析対象物に関するより包括的な情報を得ることができる。 質量分析計をHPLCシステムに接続する方法をLC/MSと呼びます。
Figure F: A Typical HPLC System
HPLC Operation
サンプル中の化合物を分離する方法を簡単に理解する方法は、図Gの図を参照するとよいでしょう。 流れの方向は緑の矢印で表されている。 これは、試料がカラムに入り、バンドを形成し始めた時間ゼロのカラムを表している。 このサンプルは黄色、赤色、青色の染料の混合物で、カラムの入口で1本の黒いバンドとして現れます。
数分後、移動相が充填剤粒子の上を安定して流れ続ける間、個々の染料が異なる速度で別々のバンドを形成して移動していることが分かります。 これは、移動相と固定相がそれぞれの色素や分析物を引き寄せるために競争しているためです。 黄色の染料のバンドが最も速く移動し、カラムから出ようとしていることに注目してください。 黄色の染料は他の染料よりも移動相を好みます。 そのため、移動速度が速く、移動相に近い速度で移動します。 青色の染料バンドは、移動相よりも充填材を好みます。 粒子への吸着力が強いため、移動速度はかなり遅くなります。 つまり、このサンプル混合物の中で最も保持されている化合物です。 赤い染料バンドは移動相と中間の吸引力を持つため、カラム内を中程度の速度で移動します。
図G: クロマトグラフィカラムの仕組み – バンド
検出器とは
分離した色素バンドは、カラムを出るとすぐに検出器に入ります。 検出器にはフローセルがあり、移動相を背景に分離した化合物のバンドを確認します。 検出器には、化合物の存在を感知し、それに対応する電気信号をコンピュータのデータステーションに送信する機能があります。
クロマトグラムとは クロマトグラムとは、HPLCシステムで化学的に生じた分離を表したものです。 ベースラインから上昇する一連のピークが時間軸上に描かれます。 それぞれのピークは、異なる化合物に対する検出器の応答を表しています。 クロマトグラムはコンピュータのデータステーションによってプロットされます。
Figure H: How Peaks Are Created
Figure Hでは、黄色のバンドが検出器のフローセルを完全に通過し、発生した電気信号がコンピュータデータステーションに送信されたところです。 その結果、クロマトグラムが画面に表示されるようになりました。 クロマトグラムは、サンプルが最初に注入されたときから始まり、画面の下部付近に設定された直線として開始されることに注意してください。 これはベースラインと呼ばれ、時間の経過とともにフローセルを通過する純粋な移動相を表しています。 黄色の分析物バンドがフローセルを通過すると、より強い信号がコンピュータに送信されます。 ラインは、サンプルバンドに含まれる黄色の色素の濃度に比例して、最初は上向きに、次に下向きにカーブします。 これにより、クロマトグラムにピークが形成されます。 黄色のバンドが検出器セルを完全に通過すると、信号レベルはベースラインに戻ります。フローセルには、再び純粋な移動相のみが存在する状態になります。 黄色のバンドは最も速く移動し、カラムから最初に溶出するため、これが最初に描かれるピークとなります。
しばらくして、赤いバンドがフローセルに到達します。赤いバンドが最初にセルに入ると、信号はベースラインから上昇し、赤いバンドを表すピークが描かれ始めます。 この図では、赤いバンドはまだフローセルを通過しきっていない。 この図で、もしこの瞬間にプロセスを停止した場合、赤いバンドと赤いピークはどのようになるかを示しています。 赤い帯の大部分はセルを通過しているので、実線で示すようにピークの大部分は描かれている。 もし再開することができれば、赤いバンドは完全にフローセルを通過し、赤いピークが完成することになります。 最も強く保持されている青いバンドは、最も遅い速度で移動し、赤いバンドより後に溶出します。 点線は、実行を最後まで継続させた場合に、完成したクロマトグラムがどのように見えるかを示しています。 青いピークの幅が最も広くなっているのは、青い分析物のバンドの幅がカラム上では最も狭いが、カラムから溶出するときに最も広くなるからです。 これは、クロマトグラフィーの充填剤層中をよりゆっくりと移動し、完全に溶出されるまでに時間がかかるためです。 移動相は一定の速度で連続的に流れているので、これは青いバンドが広がり、より希薄になることを意味します。 検出器はバンドの濃度に比例して反応するので、青いピークは高さは低くなりますが、幅は大きくなります
。