飲食物摂取後の唾液採取を用いたDNA量と質の比較

材料と方法

空軍研究所の被験者保護施設審査委員会（プロトコル番号FWR201801H）から承認を取得した。 被験者には個別に説明を行い、第三者が立会う同意文書に署名した。 Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) と Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK) を用いて5人の被験者から試料を採取した。 採取されたサンプルはすべて、参加者のタイミングの制約から、各収集の間に少なくとも30分の間隔を空けて同日に、または3日間にわたって収集された。 唾液サンプルは、製造元の指示に従い、水を飲んだ直後、昼食を食べた直後、炭酸飲料を飲んだ直後、スポーツドリンクを飲んだ直後、コーヒーを飲んだ直後の6種類を採取した

綿棒は、Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre) を用いて抽出した。 1本目の綿棒はそのまま処理し、2本目はWizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) を用いて、組織培養細胞溶解液からのゲノムDNA精製用微量遠心分離プロトコルで精製した。 サンプルはすでに溶液中であったため、細胞洗浄の工程はなかった。 唾液サンプルは、QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) を用いて、製造者の修正唾液抽出プロトコルで抽出した。

サンプルは、NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) および Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) と Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kitを用いて定量化した。 また、NanoDropは、260nmと280nmの吸光度値（A260/A280）を比較することにより、サンプルの純度を評価するために使用された。 いずれも製造元のプロトコールに従って使用した。 Qubit 濃度に基づいて 10 ng/μL に正規化した抽出サンプルは、2% E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific) を使用して分析した。 その後、Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) でサンプルを分析し、ピーナッツアレルギーに関連する 2 つの遺伝子マーカー (rs7192 および rs9275596) について検査しました。 60 ℃、1 分間の高速ランプ プリポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 設定、95 ℃、10 分間のホールドサイクル、95 ℃、15 秒、60 ℃、1 分間の 40 サイクル、60 ℃、1 分間のポスト PCR で遺伝子タイピングを実施しました。 TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を使用した。 一塩基多型（SNP）アッセイは、メーカー推奨濃度の半分の濃度で使用した。 最終容量は10μL。

結果

QuickExtract溶液を用いた綿棒抽出法では、多量のDNAが得られた。 バイオアナライザーで測定したところ、スワブから得られたDNAの値は1.38から54.2pg/µLであった（追加ファイル1: 表S1）。 しかし、私たちの研究室の以前の未報告の結果では、QuickExtract溶液抽出物から直接ライブラリーを調製した場合、シーケンシング実験が阻害されることが示されました。 そこで、Wizardカラム精製プロトコルを用いてこれらのサンプルを精製し、予想通り濃度を下げ（2.59～38.2pg/μL）、A260/A280比を一般的に認められている範囲（1.8～2.1）に近づけることができました。 A260/A280測定で示された純度は、通常DNAの範囲内であった（Additional file 1: Table S1参照）。 被験者が様々な飲み物を飲んだり、昼食をとったりした後に採取した唾液サンプルは、いずれもDNA濃度および純度の測定値が、製造元のプロトコル（30分の空腹時）を使用して採取したものと大きく異なることはなかった（図1）。

Qubit4.0読み取り値で決定した10 ng/μLに正規化した抽出サンプルは1kbラダーを用いて2%E-Gel上で実行した（追加ファイル1：図S1）。 高分子量のDNA抽出物を表すゲルの上部に向かうバンドが見られると予想された。 予想通り、様々な唾液の採取方法から抽出されたDNAは高分子量であった。 10ng/µLの入力で正規化したにもかかわらず、ほとんどの綿棒サンプルは明確なバンドを示さず、電荷の干渉物の存在か、その他の系統的な問題のいずれかを示唆した。

バイオアナライザーでより詳細にサイズと純度を分析すると、すべてのサンプルとすべての条件で、主に高分子量DNAと同様の濃度があることがわかった（図2）。 綿棒抽出物の精製後に低濃度になったことを除けば、エレクトロフェログラムのシグナルを分析したときに明らかになる、DNAの品質、サイズ、濃度における採取条件（飲食）に関連する傾向はない。

討論

遺伝子研究、商業製品、または医療介入を設計する場合、ユーザビリティとエンドユーザーの遵守は重要視する2点である。 皮膚プリックを必要とする採血デバイスは、痛みに対する嫌悪感からコンプライアンスが低くなる可能性があります。 私たちの研究室での観察から、静脈穿刺と唾液サンプリングの主な違いがある場合、研究への登録率が低下することに気づいたという逸話があります。 私たちは、この現象を調査するための対照研究は行っていません。むしろ、使いやすさ、登録率の明らかな上昇、および私たちの研究室で主に行われている研究の種類に基づいて、唾液サンプリングを行うことを選択したのです。 私たちの研究では、唾液の採取を自分で行うため、主に異なる食べ物や飲み物の摂取など、現場で起こりうる様々な採取条件下で、下流の分子アプリケーションに使用できる十分な量と質のDNAが存在するかどうかを見極めようとしたのです。 この研究デザインは、個人間の相互比較を意図したものではなく、むしろサンプル収集の被験者内変動を比較することを目的としたものである。 この目標を念頭に置き、私たちは、採取前に30分間絶食するという製造元の指示の違いによるDNA量の著しい減少を観察しませんでした

DNAの量は重要ですが、高度な分子生物学技術にとって、得られたDNAの質はより重要です。 私たちの研究では、飲食後の唾液サンプルの採取は、高分子量DNAの収量に影響を与えないことが判明しました。 このようなDNAは、次世代シーケンシング、アレイスキャン、PCRジェノタイピングに不可欠である。 さらに、PCRジェノタイピングで2つの独立した遺伝子標的を使用した実験的テストにより、これらのサンプルが分子解析に適していることが実証された

この研究の目的は、唾液DNA採取キットによる唾液採取からのDNAの質と量が、メーカーの指示に従わない、すなわち採取直前に飲んだり食べたりすることによって影響を受けるかどうかを確かめることである。 2860>

結論

遺伝子研究は、純粋に科学的な努力の領域を超え、今や一般消費者の間で一般的になっている。 これらの研究にヒトのサンプルを最適化するために、メーカーはシンプルで堅牢な収集方法の開発に努めています。 唾液採取は、これらの方法の中で最も侵襲性が低く、高品質のDNAが得られ、製品の安定性にも優れている。 様々な飲み物やスナック菓子を摂取した後の唾液から得られた DNA を調査した結果、Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix) を使用して採取した DNA の量と質には、製造元のプロトコルに従わない場合、有意差はないことが判明しました。 この研究のサンプルサイズは小さいが、我々の研究室における他の研究からの観察結果は、ここで紹介した我々の系統的比較の結果と一致している。 したがって、唾液採取は、実験室でも野外でもサンプルを収集するための強固で非侵襲的な方法であり、飲食を控えるという30分間の要件は理想であって絶対ではない、と結論づけた

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