まずはフローサイトメトリーの基礎の基礎に磨きをかけよう
フローサイトメトリーとは？
フローサイトメトリーとは、細胞や粒子の集団の物理的・化学的特性を検出・測定するための技術です。 このプロセスでは、細胞または粒子を含むサンプルを液体に懸濁し、フローサイトメーター機器に注入します。
フローサイトメトリーの目的とは何ですか？
フローサイトメトリーは、溶液中の細胞を同定する確立された方法であり、末梢血、骨髄、その他の体液の評価に最もよく使用されています。 フローサイトメトリー研究は、免疫細胞の同定および定量、血液学的悪性腫瘍の特徴付けに使用されている1。
- 細胞サイズ
- 細胞粒度
- 全DNA
- 新合成
- DNA遺伝子発現
- 表面受容体
- 細胞内受容体
- 細胞内分子量
- 細胞内分子量
- 細胞内分子量
- 細胞内分子量
- 細胞内分子量
- 細胞内分子量
- transient signal
これらの測定を非常に短時間で行えることが、フローサイトメトリープロセスの大きな利点の一つである。 1つのサンプルで、約1万個の細胞について、最大3～6個の特性または成分を1分以内に定量することができるのである。
Flow Cytometry Instrumentation and Methodology
フローサイトメーターは、単分散の単一、非塊状細胞の懸濁液を取り込み、レーザービームを通過させて一度に一つずつ（シングルファイル）実行し、それぞれの細胞がレーザービーム、散光および蛍光光を通過し、カウント、ソーティングまたはさらなる特性評価を行うもの。
フローサイトメーターの3つの主要コンポーネントは、流体系、光学系、電子機器です。
- フローサイトメーターの流体系は、サンプルをサンプルチューブからフローセルに運び、レーザーを通過させて、ソートおよび/または廃棄する役割を果たします。
- 光学系のコンポーネントは、光の波長を収集して装置内で動かすために用いられる励起光源、レンズ、光学フィルターと光電流を生み出す検出系が含まれます。 データ中の波長反応の違いは、細胞の種類を分析するのに役立ちます。
- エレクトロニクスまたはフローサイトメーターの機器。
フローサイトメトリーを使用する主な原則の1つは、細胞サイクルを完全に分析し、異なるフェーズのDNA含有量を分析する能力を持っていることです。 細胞周期の自然現象をモニタリングすることで、疾病診断や治療予後のための情報を得ることができる。 細胞周期のさまざまなフェーズにおいて、DNA量の変化や、腫瘍の存在や進行した細胞死の兆候を示すその他の異常が明らかになることがあります。 解析されたデータは、専用のフローサイトメトリーソフトウェアを介してコンピュータに保存されます。 フローサイトメトリーデータは、通常、ヒストグラムおよび/またはドットプロット2という2つの異なる方法で報告される。
| G1期： | RNA、リボソーム、タンパク質が合成される |
| S期： | DNAが複製される |
| G2期： | |
| S期： | DNA合成と有糸分裂の間の段階を表す |
| M phase: |
FACS
蛍光活性細胞選別（FACS）はフローサイトメトリの特殊型であり、FACSはDNA合成と細胞分裂の間にある。 これは、生物学的細胞の異種混合物を、各細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、一度に1つの細胞ずつ2つ以上の容器に分類する方法を提供するものである。 フローサイトメトリーとは、単に細胞を数えたり選別したりするだけでなく、独自の特性評価を行う点で異なります。 この2つの原理は、フローサイトメトリー分析の完全な定性的および定量的アプローチを提供するために、コ・キャラクタリゼーション型のプロセスで機能するのが一般的である。
フローサイトメトリープロセス。
細胞懸濁液は、狭い、急速に流れる液体の流れの中心に巻き込まれる。 流れは、細胞の直径に対して細胞間の分離が大きくなるように配置される。 振動機構により、細胞の流れが個々の液滴に分解されるように強制される。 このとき、1つの液滴に複数の細胞が存在する可能性が低くなるように調整されている。 液滴になる直前に蛍光測定ステーションを通過し、各細胞の蛍光特性が測定される。
電荷リングは、流れが液滴に変わる地点に置かれる。 直前の蛍光強度測定に基づいてリングに電荷が置かれ、流れから壊れるときに反対の電荷が液滴に捕捉される。 帯電した液滴は、静電偏向システムを通って落下し、その電荷に基づいて液滴を容器に分流させる。 一部のシステムでは、電荷はストリームに直接印加され、分離した液滴はストリームと同じ符号の電荷を保持する。
特定の細胞表面タンパク質に特異的な抗体を蛍光分子と結合させ、細胞の混合物に添加します。 次のステップは蛍光のプロセスであり、一方、特定の細胞は、彼らが監視されるレーザービームを通過する。 細胞1個を含む液滴は、その細胞が蛍光標識抗体を持つかどうかに基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を付与される。 単一細胞を含む液滴は、電界によって検出され、その電荷に応じて別々の収集管に振り分けられ、蛍光抗体でマークされた細胞を容易に分離することができる。
Multicolor flow cytometry
Multicolor flow cytometryは、ヒトや動物サンプルの血液と組織細胞のような、細胞の混合集団を調べる際に有用な技術である。 一般に、特定の細胞種をフルオロフォアやヨウ化プロピジウムのような蛍光色素（マーカー）で標識する。 複数の蛍光マーカーを同時に使用することができるため、複数の細胞タイプの識別や、各サンプルの特徴をより明確にする機能的なマーカーを使用することができる。 12色以上の色を測定できる専用の装置もある3,4 。 これらの蛍光色素やマーカーは、レーザーから発せられる異なる波長の光によって測定され、個々の細胞タイプごとに選別される。
一般的な染色パネルを4～6色から12色以上に適応させることは、単に「プラグアンドプレイ」の問題ではなく、染色パネルのパラメータを成功させるために系統的にアプローチする必要があります。 パネル設計の基本原則は、使用前の調査に基づいて最も効果的に機能します。 つまり、蛍光色素を輝度5で効果的にマッチングさせるためには、ステインインデックスを参照する最初のプロセスから準備が重要なのです。
Flow Cytometry Tip:
一次抗体パネルをデザインする前に、フローサイトメーターの微妙なニュアンスを理解するために時間をかけてください。 そのシステムで最も高感度な測定が可能な場所に着目してください。
チャンネルエラーを避けるために、より明るくない蛍光色素で代用することを検討してください。
Common Applications of Flow Cytometry Methodology
フローサイトメトリーは、診断、治療計画、静的または進行性の全身疾患を含むいくつかの臨床領域において不可欠な要素である。 フローサイトメトリーで使用するための実用的なアプリケーションについて学ぶにつれて、知識ベースはさらに拡大されています。 現在では、以前にも増して、研究者は特定の疾患や病態の複雑さをより深く知ることができるようになり、非常に興奮しています。 それは、パターン化された診断に迅速な変化をもたらし、癌などの疾患を治療するための医療アプローチに劇的な変化をもたらしています6。
フローサイトメトリーの方法論は、しばしば形態学的検査など他の包括的な検査パターンに関与している。 多くの場合、血液新生物は特異的な形態学的変化を描き、フローサイトメトリーはより高い特異性を提供し、病理医が組織の異常や他の進行した疾患を拡大するのに役立つ。 フローサイトメトリーは、場合によっては、形態学的変化が検出される前に、がんの再発を事前に判断することができます7。
治療および研究志向の両方の現代の臨床環境の範囲内で使用される主要アプリケーションのいくつかは、以下を含みます。
- タンパク質発現-細胞全体、核でさえも
- タンパク質翻訳後修飾-切断およびリン酸化タンパク質を含む
- RNA- miRNA の両方を含む
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- 細胞の健康状態-アポトーシス細胞または細胞死の検出
- 細胞周期の状態-G0/G1期の細胞、S期、G2、または倍数体を評価するための強力なツールを提供します。 細胞増殖および活性化の分析を含む
- 異種サンプル内の異なる細胞サブセットの同定および特性評価-中心エフェクター記憶細胞と疲弊したT細胞または制御性T細胞の区別を含む
Wrapping Up
フローサイトメトリの基本原理はこの10年間でほとんど変わっていませんが、この技術のアプリケーションは大きく発展しています。 フローサイトメトリーの基礎は、その主要な機能である、細胞が固定された検出器のセットを通過する際に、流れの中の個々の細胞や粒子をレーザーで照会することと一貫している。 高速ソーティングや分析機能8と並んで、より多くの色の蛍光がサイトメーターで検出されるようになってきています。
フローサイトメトリーは分子科学研究において不可欠な役割を担っており、急速な進化を続けている。 市販のフローサイトメーターは数種類ある。 これらは同じ基本原理で動作する傾向があるが、その設計、アライメントや他のコンポーネントの統合に関する概念に重要な違いがある。
近い将来、3D装置が導入され、ナノセレクト・バイオメディカルが製造するハイブリッドな独自の装置、WOLFセルソーターに組み込まれる予定です。 また、ナロースペクトル蛍光プローブの開発、分子生物学的手法とフローサイトメトリーの統合、サイトカインなどの無細胞マーカーの評価は、フローサイトメトリー解析と細胞アッセイ技術の継続的な進化における重要な要素になると期待されます」
Sources:
1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221
2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/
3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959
4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26
5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250
6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/
7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/
8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543