PMC

DNE-k a transzkripciós szabályozásban

DNE-k a transzkripciós szabályozással összefüggésben is előfordulhatnak. DNE-t kaphatunk például egy moduláris TF transzaktivációs doménjének eltávolításával, így csak a DNS-kötő domén marad meg. Ez a csonka faktor a transzkripció kompetitív inhibitoraként viselkedhet. Ez a természetben is előfordul. Az emlősökben például a C/EBP fehérje három alternatív polipeptid formájában fejeződik ki. A hosszabb polipeptidek tartalmaznak egy N-terminális transzkripciós aktiváló domént, míg a rövid formából ez hiányzik. Mivel a hosszú és rövid izoformák homo- és heterodimerekké állnak össze, az utóbbi természetes DN-ként viselkedik (Zahnow és mtsai., 1997). Ez a helyzet a gerinceseknél a Stats 5 és 6 esetében is, amelyek képesek dimerizálódni. Fiziológiai jelekre adott proteolitikus feldolgozásuk a C-terminális aktiváló domén eltávolításához vezet, és erős inhibitorokká alakítja őket, amelyek negatívan szabályozzák a jelátvitelt (Nakajima és mtsai., 2003). Növényekben számos MYB fehérje transzkripciós regulátorként működik. Arabidopsisban az egyetlen MYB DNS-kötő ismétlődést tartalmazó, de a transzaktivációs domént nélkülöző fehérjék részt vesznek az epidermális sejtsors aspektusainak meghatározásában. Ezek a fehérjék más TF-ekkel, köztük bHLH fehérjékkel lépnek kölcsönhatásba, és a transzaktivátor domén hiánya miatt DN és transz-DN-ként viselkednek, inaktív komplexeket alkotva (Ramsay és Glover, 2005).

A DNS-kötő domén eltávolítása szintén DNE-khez vezethet. Ez történik a bHLH TF-ek esetében. Mint fentebb említettük, az Id-1 gén ennek a TF-családnak egy természetesen előforduló DN-inhibitorát kódolja. A teljes bHLH fehérjék (DNS-kötő és dimerizációs doménnel) konstitutívan is kifejeződhetnek. A csak a dimerizációs domént tartalmazó Id-1 szabályozott expressziója azonban a bHLH fehérjék aktivitásának szabályozását kényszeríti ki (Sun, 1994). Hasonló jelenség várható a növényekben is. Az Arabidopsis genomja például ∼120 olyan bHLH fehérjét kódol, amelyekről előre jelezték, hogy DNS-hez kötődnek, és 27 olyan fehérjét, amelynek bázikus régiója kisebb a kötődéshez szükségesnél (Toledo-Ortiz és mtsai., 2003). Ezek a nem DNS-kötő HLH-k az állati Id fehérjékhez hasonlóan, a DNS-kötésre képtelen heterodimerek kialakításán keresztül a bHLH fehérjék negatív szabályozóiként működhetnek (Toledo-Ortiz et al., 2003). Hasonló hatás várható a bázikus domén/leucin cipzár (bZIP) családba tartozó TF-ek esetében, amelyek tartalmaznak egy bázikus DNS-kötő motívumot, egy leucin cipzár dimerizációs domént és transzaktiváló doméneket. Az Arabidopsis 67 bZIP fehérjét kódol, amelyek mindegyike az előrejelzések szerint homo- és/vagy heterodimerként működik (Deppmann és mtsai., 2004). Ezek közül néhány nagyon kicsi, és hiányozhat belőlük az aktiváló domén. Egy klasszikus növényi példában Fukazawa és munkatársai (2000) a bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) funkcióját tisztázták a gibberellin jelátvitelben az RSG DN formájának felhasználásával, amelyből hiányzott a transzkripciós aktiváló domén, és ezért a vad típusú fehérje funkciójának elnyomására hatott, amikor transzgenikus dohányban kifejeződött. Továbbá, összhangban azzal, amit a transz-DN-ekkel túlexpresszióval foglalkozó részben említettünk, a DNS-fehérje transzkripciós komplexek is érzékenyek a géndózis egyensúlyára (Birchler és mtsai., 2001; Veitia, 2002). Ennek az egyensúlynak a megváltozása egy TF csökkent vagy fokozott expressziója révén az ugyanabban a komplexben részt vevő többi TF-hez képest abnormális fenotípusokat indukálhat.

A transzkripciós aktiváció egyszerű modellje felhasználható a DN-mutációk néhány mennyiségi finomságának feltárására ebben az összefüggésben. A vírusos rendszereken és a Drosophilán végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a transzkripció gyakran szigmoidális kapcsolatot mutat egy TF koncentrációjának függvényében. Egyetlen típusú aktivátorra (A) reagáló rendszer esetében ez a szigmoidális válasz két fő összetevőre bontható: A kooperatív kötődése a célgén promóteréhez (p) és a szinergia (6. ábra). A szinergia a promóterhez már kötődő A molekulák és a transzkripciós gépezet közötti összehangolt kölcsönhatások eredménye (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Gondoljunk egy p promóterre, amely két kötőhelyet tartalmaz A számára. Ugyanezeket a kötőhelyeket ismeri fel az a változat is, amely kompetitív inhibitorként viselkedhet. Feltételezzük, hogy az A molekulák és a promóter közötti kölcsönhatás során kooperativitás állhat fenn. Ez az A, a és a promóter közötti kölcsönhatásokra is igaz lehet. A kooperativitás egyik lehetséges forrását már említettük fentebb (azaz az A hajlamos dimereket képezni oldatban, de ez a DNS-kötés során fokozódik). Egy másik lehetőség, hogy a monomerek oldatban nem tudnak kölcsönhatásba lépni, és az egyik monomer és a DNS kölcsönhatása olyan allosztérikus változáshoz vezet, amely növeli a kötött A affinitását a beérkező monomerhez. Az is lehetséges, bár kevésbé valószínű, hogy nincsenek A-A kölcsönhatások, és az egyik monomer kötődése a DNS-hez a szomszédos helyen olyan változást eredményez, amely növeli annak affinitását egy újonnan érkező monomerrel szemben. Bármi legyen is a helyzet, a kooperativitás azt jelenti, hogy a pA + A = pAA reakció könnyebben megy végbe, mint a p + A = pA.

A szinergia megléte miatt a transzkripcióhoz leginkább hozzájáruló molekulafajta a két aktivátor molekula által elfoglalt promóter: a pAA. Ez azt is jelenti, hogy ha a pA és a polimeráz komplex közötti asszociáció affinitási állandója KpolA, akkor a pAA és a polimeráz asszociációjának K értéke sokkal nagyobb lesz, mint 2K (K2polA nagyságrendű; lásd Zlotnick, 1994). A részleges transzaktivációs aktivitás befogadására ebben a modellben Kpola (a pa + pol reakcióra) és Kpola2 (a paa + pol reakcióra) fogunk használni. E feltételezések mellett a transzkripciós válasz (TR) egyenlete az A (és a) koncentrációjának függvényében levezethető a Veitia (2003) és Veitia és Nijhout (2006) által leírtak szerint (lásd a Kiegészítő anyagok online).

Egy meglehetősen egyszerű egyenlet birtokában számos körülmény vizsgálható: (1) a vad típusú A/A helyzet, (2) amikor hiányzik egy allél (A/-), és (3) amikor az A és egy csonka, a transzaktivációs domént nélkülöző a változat együttes expressziója áll fenn. Az utóbbi esetben két különböző helyzetet különböztethetünk meg: (3a) amikor az a mutációja megszünteti a kooperativitást, vagy (3b) amikor A és a kooperatív kölcsönhatásban van. Végül megvizsgálhatunk egy olyan helyzetet is (4), amikor az a transzaktivációs kapacitása normális és a kooperativitás hiányzik, és (5) amikor a kooperativitás normális, de a transzaktivációs kapacitás részleges.

A 7. ábrán látható, hogy a TR, a promóter maximális kimenetéhez viszonyítva versus egy szigmoidális összefüggést mutat, amely 0 és 1 között mozog. A telítettség a rendszer maximális válaszát tükrözi, de ez nem jelenti azt, hogy a promóter csak telítettségben működik. Az ábra szerint és általában a görbe értékei a heterozigóta A/- esetében bármely ponton alacsonyabbak, mint az A/A esetében (a relatív , a heterozigóta A/- minden egyes értékére abszolút értékben kétszer kevesebb, mint a vad típusé). Érdekes módon az A alacsony relatív koncentrációinál a görbék közötti eltolódás nagyon kifejezett Y(A/-) ∼25%-a az Y(A/A)-nak. Azonban, ahogyan az intuitíve várható volt, magas A értékek esetén a telítettséget az A/- is eléri. Ha ez a rendszer normálisan működne A alacsony koncentrációinál, akkor egy A/- egyed tipikus haploinsufficient fenotípust mutatna.

Mi történik az A/a-ban, ha a kooperativitás hiányában az a-ból hiányzik a transzaktivációs domén? A klasszikus DN definíció szerint a görbe minden ponton alacsonyabb, mint A/- esetében. Azonban van egy tendencia a telítettség elérésére az A és a növekvő koncentrációjával. Valójában az A hajlamos arra, hogy preferenciálisan elfoglalja a promótert, mivel kooperatív kölcsönhatásokat biztosít a beérkező A monomerekkel. Nyilvánvaló azonban, hogy a promóter felismerése alacsony fehérjekoncentráció esetén kevésbé könnyen történik A/a-ban, mint a vad típusú állapotban. A gyakorlatban egy csonka monomer, amely nem képes kooperatív kölcsönhatásokat biztosítani, gyenge DNE-t eredményez. Teljesen más a helyzet a másik végletben, amikor az A és az a közötti kooperativitás teljes mértékben fennmarad. Az A/a görbe platóját TR = 0,25-nél érjük el. Ez azért várható, mert a pAA, amely a transzkripciót hajtja (azaz a pAa és a paa hozzájárulása elhanyagolható), telítettség esetén a foglalt promóterfajoknak csak 25%-át képviseli.

Egy lehetséges példát a TF FOXL2 mesterséges mutációja szolgáltat. Ez a TF elnyomja a humán szteroidogén akut szabályozó gén promóterét, amely több feltételezett kötőhelyet tartalmaz. A FOXL2 egy olyan változata, amely tartalmazza a DNS-kötő domént, de hiányzik a C-terminális domén, képes olyan DNE-t indukálni, amely károsítja a transzkripciós repressziót. Ez a hatás azonban csak akkor érhető el, ha a DN változat sokkal erősebben (5× és 10×) expresszálódik, mint a vad típusú fehérje (Pisarska és mtsai., 2004). A fentiekben vázoltak szerint ez a FOXL2 molekulák közötti kooperatív kölcsönhatások hiányának tudható be ezen a promóteren.

Egy még beszédesebb példát mutat a 8. ábra, amely két különböző, a TF PTX2a és annak DN változata számára egy vagy két kötőhelyet tartalmazó promóter válaszát ábrázolja a korábban leírtak szerint (Saadi et al., 2003. A transzfektáló DNS kis mennyiségénél (0,05 μg a 8. ábrán) a két kötőhelyet tartalmazó promóter válasza több mint kétszer erősebb (azaz 3×), mint a csak egy kötőhelyet tartalmazó promóter válasza. Ez a kooperativitás és a szinergia együttes jele. Sőt, a WT+DN transzfektáló konstrukciók magas koncentrációinál a két kötőhellyel rendelkező promóter TR értéke ∼25%-a a csak a vad típus válaszának. Ez azért várható, mert magas fehérjekoncentráció esetén a dimerek már a cél-DNS elérése előtt előzetesen összeállhatnak. Ebben az esetben a dimereknek csak 25%-a lesz normális. A TR csökkenése kevésbé drámai a csak egy kötőhellyel rendelkező promóter esetében (várhatóan 50%). Gyakorlati szempontból, hogy elkerüljük egy esetleges DNE figyelmen kívül hagyását in vitro kísérletekben, a WT+DN konstrukciókat kis mennyiségben kell transzfektálni a riporter promóter feleslegével, hogy elkerüljük annak telítődését a vad típusú formával. Általánosabban, az ilyen transzfekciós kísérletekhez különböző TF-koncentrációkra vonatkozó válaszgörbéket kell biztosítani.

Amint az intuitíve várható volt, amikor az a transzaktivációs kapacitása normális és a kooperativitás hiányzik, egy nagyon enyhe DNE jelenik meg, amely heterozigóta állapotban a null allélhez közeli viselkedéshez vezet. Az ilyen típusú mutánsok izolálása egy Burz és Hanes (2001) által leírt elegáns élesztőgenetikai szűréssel lehetséges. A mutáció kevésbé drámaian befolyásolhatja a kooperativitás szintjét. Érdekes eset áll fenn, amikor a kooperativitás a normális szint körülbelül egytizedére csökken (a 7. ábrán bemutatott eredmények alapjául szolgáló paraméterek szerint), és a transzaktivációs kapacitás normális. Ilyen körülmények között az a variáns hipomorf allélként viselkedik a homozigóta a/a-ban és null allélként az A/a-ban (azaz A/a = A/-; az adatok nem láthatóak). Ez ismét rávilágít a hipomorfikus, DN és null allélok közötti határozott határvonal hiányára.

Ha van maradék transzaktiváció (azaz 1<Kpola<KpolA) és a kooperativitás normális, az A/a-ban a plató nem TR = 1-nél, hanem egy alacsonyabb szinten érhető el. A részleges aktiválóképességű allélok bizonyos esetekben könnyen előállíthatók. A paradigmát az élesztő TF Gal4 szolgáltatja, amely két aktiváló régiót (ARI és ARII) tartalmaz, amelyek a transzkripciós gépezet toborzásában vesznek részt. Az ARII savas régió deléciója a transzaktivációs kapacitás csökkenéséhez vezet (Ptashne és Gann, 2002; Ptashne, 2007). Egy ilyen allél és a vad típusú Gal4 kombinációjának a leírtak szerint kell viselkednie. Amint a 7. ábrán látható, az A/a görbe keresztezi az A/- görbét. Így ugyanaz az allél lehet hipomorf, ha a rendszer alacsony telítettségi szinteken működik (mielőtt a görbék metszik egymást), és magasabb fehérjekoncentrációknál molekulárisan DN lehet. Erre egy intuitív magyarázat adható. Vegyünk például egy olyan a fehérjét, amely a polimerázzal mondjuk a vad típusú erősség 90%-ával lép kölcsönhatásba. Egy bizonyos koncentrációtartományban a heterozigóta A/a hajlamos lesz úgy viselkedni, mint az A/A. Telítettség esetén azonban a promóter fajnak csak 25%-a lesz pAA, amely maximális erővel lép kölcsönhatásba a polimerázzal. Ezzel szemben az A/- heterozigóta esetében alacsony fehérjekoncentrációknál nehezebben foglalja el a promótert, míg telítettségnél a promóterfajok 100%-a pAA lesz. Így az A/a és az A/- görbéknek egy ponton metszeniük kell egymást.

Egy sejten belül nem minden célpromóter egyformán érzékeny egy DN TF-re. Erős kooperativitás és szinergia esetén egy promóter DN fehérjével szembeni érzékenységének a DNS-en lévő kötőhelyek számától kell függenie. A legegyszerűbben szemléltethető eset az, amikor a-nak nincs transzaktivációs doménje, de kooperatív kölcsönhatásban van A-val. Ha a transzkripciót vezérlő promóterfaj a vad típusú fehérjével teljesen betöltött promóter, amint azt fentebb feltételeztük, a maximális TR kiszámítható a Kiegészítő anyagok online kiadásában megadott képlet (a binomiális valószínűségek) segítségével. Két azonos kötőhellyel rendelkező promóter esetén a maximális TR 25% lesz a vad típusú állapot kimenetéhez képest: három kötőhely esetén 12,5%, négy kötőhely esetén pedig 6,25% (ha az A és az a ekvimoláris koncentrációban van kifejezve). Bonyolultabb helyzetek esetén a válasz nem intuitív, és olyan modellek elemzését igényli, amelyekkel itt nem foglalkozunk.