Hogyan működik az áramlási citometria?

Lássuk először az áramlási citometria alapjait

Mi az áramlási citometria?

A flow-citometria a sejtek vagy részecskék populációjának fizikai és kémiai jellemzőinek kimutatására és mérésére használt technika. Ebben az eljárásban a sejteket vagy részecskéket tartalmazó mintát folyadékban szuszpendálják, és befecskendezik az áramlási citométer műszerbe.

Mire szolgál az áramlási citometria?

Az áramlási citometria jól bevált módszert biztosít az oldatban lévő sejtek azonosítására, és leggyakrabban a perifériás vér, a csontvelő és más testfolyadékok értékelésére használják. Az áramlási citometriás vizsgálatokat az immunsejtek azonosítására és számszerűsítésére, valamint a hematológiai malignitások jellemzésére használják.1 Mérni lehet:

• sejtméretet
• sejtszemcsézettséget
• teljes DNS
• új szintetizált
• DNS génexpressziót
• felszíni receptorokat
• intracellulárisan. fehérjék
• tranziens jel

Az áramlási citometriai eljárás egyik legfontosabb előnye, hogy ezeket a méréseket nagyon rövid idő alatt lehet elvégezni. Akár három-hat tulajdonságot vagy komponenst is képesek számszerűsíteni egyetlen mintában, sejtről sejtre, körülbelül 10 000 sejtre, kevesebb mint egy perc alatt.

Áramlási citometria műszerezettség és módszertan

Az áramlási citométerek monodiszperz egyes, nem csomósodott sejtek szuszpenzióját veszik be, és egyenként (single file) egy lézersugár mellett vezetik el őket, ahol minden egyes sejt áthalad a lézersugáron, a szórt és fluoreszcens fényen, majd megszámolják és rendezik vagy tovább jellemzik.

Az áramlási citométer három fő összetevője a fluidika, az optika és az elektronika.

• Az áramlási citométer fluidikai rendszere felelős a mintáknak a mintacsőből az áramlási cellába történő szállításáért, a lézer mellett való elhaladásáért, válogatásáért és/vagy selejtezéséért.
• Az optikai rendszer összetevői közé tartoznak a gerjesztő fényforrások, lencsék és optikai szűrők, amelyeket a fény hullámhosszának a műszerben történő összegyűjtésére és mozgatására használnak, valamint a fotóáramot generáló detektáló rendszer. Az adatok hullámhossz-válaszának különbsége segít a sejttípus elemzésében.
• Az elektronika vagy az áramlási citométer műszerezettsége.

Az áramlási citometria használatának egyik fő elve, hogy képes a teljes sejtciklus elemzésére és a DNS-tartalom elemzésére a különböző fázisokban. A sejtciklus természetes eseményeinek nyomon követése információt szolgáltathat a betegségek diagnosztizálásához és a terápia előrejelzéséhez. A sejtciklus különböző fázisai feltárhatják a megváltozott DNS-tartalmat és más rendellenességeket, amelyek a tumor jelenlétére vagy az előrehaladott sejthalál jeleire utalnak. Az adatkifejezéseket az elemzés idején a választott műszerhasználathoz kapcsolódó speciális áramlási citometriás szoftver segítségével számítógépen tárolják. Az áramlási citometriai adatokat jellemzően két különböző módon jelentik: hisztogram és/vagy pontdiagram2.

G1 fázis:	RNS, riboszómák és fehérjék szintetizálódnak
S fázis:	DNS replikálódik
G2 fázis:	A DNS-szintézis és a mitózis közötti fázist jelenti
M fázis:	a sejtek két leánysejtre osztódnak

FACS

A fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás (FACS) az áramlási citometria egy speciális típusa. Módszert biztosít biológiai sejtek heterogén keverékének két vagy több tartályba történő szétválogatására, egyenként egy-egy sejtre, az egyes sejtek sajátos fényszórási és fluoreszcens tulajdonságai alapján. Abban különbözik az áramlási citometriától, hogy a sejtek puszta megszámlálásával és szétválogatásával szemben egyedi jellemzést biztosít. Gyakori, hogy a két elv együttes jellemzés típusú folyamatban működik, hogy teljes minőségi és mennyiségi megközelítést kínáljon az áramlási citometriai elemzéshez képest.

Az áramlási citometriai folyamat:

A sejtszuszpenziót egy keskeny, gyorsan áramló folyadékáram közepébe terelik. Az áramlást úgy alakítják ki, hogy a sejtek között átmérőjükhöz képest nagy távolság legyen. Egy rezgő mechanizmus arra kényszeríti a sejtáramot, hogy egyes cseppekre bomoljon. A rendszert úgy állítják be, hogy cseppenként egynél több sejtnek kicsi legyen a valószínűsége. Közvetlenül azelőtt, hogy az áram cseppekre törne, az áramlás egy fluoreszcenciamérő állomáson halad át, ahol az egyes sejtek fluoreszcens tulajdonságát mérik.

Egy elektromos töltőgyűrűt közvetlenül azon a ponton helyeznek el, ahol az áramlat cseppekre törik. A gyűrűre a közvetlenül megelőző fluoreszcencia-intenzitásmérés alapján egy töltést helyeznek, és az ellenkező töltés a cseppeken ragad, amikor azok kiszakadnak az áramlatból. A feltöltött cseppek ezután átesnek egy elektrosztatikus terelőrendszeren, amely a cseppeket töltésük alapján tartályokba tereli. Egyes rendszerekben a töltést közvetlenül az áramlásra alkalmazzák, és a leszakadó csepp megtartja az áramlással azonos előjelű töltést. A csepp letörése után az áramlás semleges állapotba kerül vissza.

Egy adott sejtfelszíni fehérjére specifikus antitestet egy fluoreszcens molekulával társítanak, majd egy sejtkeverékhez adják. A következő lépés a fluoreszcencia folyamata, míg, a specifikus sejtek áthaladnak egy lézersugáron, azokat figyelik. Az egyes sejteket tartalmazó cseppek pozitív vagy negatív töltést kapnak, attól függően, hogy a sejt rendelkezik-e fluoreszcens jelölésű antitesttel. Az egyetlen sejtet tartalmazó cseppeket ezután egy elektromos mező érzékeli, és töltésüknek megfelelően külön gyűjtőcsövekbe irányítja, lehetővé téve a fluoreszcens antitesttel jelölt sejtek könnyű elkülönítését.

Multicolor áramlási citometria

A multicolor áramlási citometria hasznos technika a vegyes sejtpopulációk, például emberi és állati mintákban lévő vér- és szövetsejtek vizsgálatakor. Általában egy adott sejttípust fluoreszcens festékkel (markerekkel), például fluorofórral vagy propídium-jodiddal jelölnek. A több fluoreszcens marker egyidejű használatának képessége lehetővé teszi több sejttípus azonosítását, valamint az egyes minták további jellemzésére szolgáló funkcionális markereket. Léteznek olyan speciális műszerek, amelyek több mint 12 szín mérésére képesek 3,4 . Ezeket a fluoreszcens festékeket és markereket a lézer által kibocsátott fény különböző hullámhosszúságával mérik az egyes sejttípusok szerinti válogatáshoz. Minden egyes markert egy adott fényhullámhosszon gerjesztünk, hogy több marker használata esetén megkülönböztessük őket.

Egy tipikus festőpanel 4-6 színről több mint 12 színre történő adaptálása nem egyszerűen “plug and play” kérdése, hanem szisztematikusan kell megközelíteni a festőpanel sikeres paramétereinek eléréséhez. A paneltervezés alapelvei a felhasználás előtti kutatás alapján működnek a legjobban. Más szóval, az előkészítés már a festékindexre való hivatkozás kezdeti folyamatától kezdve kulcsfontosságú a fluorokrómok fényerősség szerinti hatékony illesztése tekintetében5.

Folyócitometriás tipp:

Fektessen némi időt az áramlási citométer finom árnyalatainak megértésére, mielőtt megtervezné az elsődleges ellenanyagpanelt. Koncentráljon arra, hogy hol lehet a legérzékenyebb méréseket végezni a rendszeren. Többről van szó, mint pusztán a fluoreszcencia intenzitásáról.

A csatornahibák elkerülése érdekében fontolja meg egy kevésbé fényes fluorokróm helyettesítését.

A flow-citometria módszertanának gyakori alkalmazásai

A flow-citometria számos klinikai terület szerves részét képezi, beleértve a diagnózist, a kezelési terveket és a szisztémás betegségeket, legyenek azok statikusak vagy progresszívek. Ahogy egyre többet tudunk meg az áramlási citometria gyakorlati alkalmazásáról, úgy bővül tovább a tudásbázis. Most minden eddiginél jobban izgatja a kutatókat, hogy többet tudhatnak meg bizonyos betegségek és állapotok összetettségéről. Ez gyors változást eredményezett a diagnosztikai mintákban, és drasztikusan megváltoztatta a betegségek, például a rák kezelésének orvosi megközelítéseit6.

A flow-citometriás módszertan gyakran más átfogó vizsgálati mintákkal, például morfológiai vizsgálattal is együtt jár. Sok esetben a hematológiai neoplazmák specifikus morfológiai változásokat ábrázolnak, és az áramlási citometria nagyobb specificitást biztosít, és segít a patológusoknak a szöveti anomáliák vagy más előrehaladott betegségek kiterjesztésében. Az áramlási citometria bizonyos esetekben képes előre meghatározni a rák kiújulását, mielőtt morfológiai elváltozásokat észlelnének7.

A modern klinikai környezetben alkalmazott néhány főbb, mind terápiás, mind kutatási célú alkalmazás közé tartozik:

• Protein expresszió – az egész sejtben, még a sejtmagban is
• Protein poszt-transzlációs módosítások – beleértve a hasított és foszforilált fehérjéket
• RNS – beleértve mind a miRNS-t, és mRNS-átiratokat is
• Cellák egészségi állapota – apoptotikus sejtek vagy sejthalál kimutatása
• Cellciklus állapota – hatékony eszköz a G0/G1 fázisban lévő sejtek értékelésére az S fázissal, G2-vel vagy poliploiditással szemben, beleértve a sejtproliferáció és -aktiváció elemzését
• A heterogén mintán belüli különböző sejtalcsoportok azonosítása és jellemzése – beleértve a központi effektor memóriasejtek megkülönböztetését a kimerült T-sejtektől vagy a szabályozó T-sejtektől

Összefoglalás

Az áramlási citometria alapelvei az elmúlt évtizedben alig változtak, de a technológia alkalmazásai sokat fejlődtek. Az áramlási citometria alapjai összhangban voltak elsődleges funkciójával, amely az áramlásban lévő egyes sejtek vagy részecskék lézerrel történő lekérdezése, miközben a sejtek elmennek egy sor helyhez kötött detektor mellett. Egyre több színű fluoreszcenciát detektálnak a citométerek, a nagy sebességű szortírozás és az analitikai funkció mellett8.

A flow-citometria szerves szerepet játszik a molekuláris tudományok kutatásában, és továbbra is gyors ütemben fejlődik. Számos kereskedelmi forgalomban lévő áramlási citométer van forgalomban. Ezek általában ugyanazon az alapelven működnek, de lényeges különbségek vannak a kialakításukban, valamint az összehangolásra és más komponensek integrálására vonatkozó koncepciókban.

A horizonton hamarosan egy 3D műszer kerül bevezetésre és beépítésre a NanoCellect Biomedical által gyártott hibrid saját műszerbe, a WOLF Cell Sorterbe. Várható továbbá a keskeny spektrumú fluoreszcens szondák fejlesztése, a molekuláris biológiai technikák integrálása az áramlási citometriával, valamint a sejtmentes markerek, például a citokinek kiértékelése is kulcsfontosságú komponensek lesznek az áramlási citometriai elemzés és a sejtvizsgálati technológia folyamatos fejlődésében.

Források:

1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221

2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/

3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959

4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26

5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250

6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/

7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/

8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543