Az alapvető nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás rendszer összetevői az E. ábrán látható egyszerű ábrán láthatók.
A tartályban tartjuk az oldószert . Egy nagynyomású szivattyút használnak a mozgófázis meghatározott áramlási sebességének előállítására és mérésére, jellemzően milliliter per perc. Egy injektor képes bevezetni a mintát a folyamatosan áramló mobilfázis áramába, amely a mintát a HPLC oszlopba szállítja. Az oszlop tartalmazza az elválasztáshoz szükséges kromatográfiás töltőanyagot. Ezt a töltőanyagot nevezzük állófázisnak, mivel az oszlop hardvere tartja a helyén. A HPLC-oszlopból történő eluálás során az elválasztott vegyület-sávok megjelenítéséhez detektorra van szükség. A mozgó fázis kilép a detektorból, és tetszés szerint a hulladékba kerülhet, vagy összegyűjthető. Ha a mobilfázis tartalmaz egy elválasztott vegyületsávot, a HPLC lehetővé teszi, hogy az eluátumnak ezt az adott tisztított vegyületet tartalmazó frakcióját további vizsgálat céljából összegyűjtsük. Ezt nevezzük preparatív kromatográfiának .
Megjegyezzük, hogy nagynyomású csöveket és szerelvényeket használunk a szivattyú, az injektor, az oszlop és a detektor alkatrészeinek összekapcsolására, hogy a mobilfázis, a minta és az elválasztott vegyületsávok vezetéke legyen.
E ábra: Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszer
A detektor a számítógépes adatállomással van összekötve, a HPLC-rendszer azon komponensével, amely rögzíti a kromatogram megjelenítéséhez szükséges elektromos jelet a kijelzőjén, valamint a minta összetevőinek koncentrációjának azonosításához és mennyiségi meghatározásához (lásd az F ábrát). Mivel a mintaösszetevők jellemzői nagyon különbözőek lehetnek, többféle detektortípust fejlesztettek ki. Ha például egy vegyület képes elnyelni az ultraibolya fényt, akkor UV-abszorpciós detektort használnak. Ha a vegyület fluoreszkál, akkor fluoreszcencia detektort használnak. Ha a vegyület nem rendelkezik e jellemzők egyikével sem, akkor egy univerzálisabb típusú detektort használnak, például egy párolgási-fényszórásos detektort. A leghatékonyabb megközelítés több detektor soros használata. Például UV és/vagy ELSD detektor használható tömegspektrométerrel kombinálva a kromatográfiás elválasztás eredményeinek elemzésére. Ezáltal egyetlen injekcióból átfogóbb információt kapunk az analitről. A tömegspektrométer és a HPLC-rendszer összekapcsolásának gyakorlatát LC/MS-nek nevezzük.
F ábra: Egy tipikus HPLC-rendszer
HPLC működése
A G ábrán látható ábra segítségével egyszerűen megérthetjük, hogyan érjük el a mintában lévő vegyületek elválasztását.
A mozgó fázis balról lép be az oszlopba, áthalad a részecskeágyon, és jobbra lép ki. Az áramlás irányát zöld nyilak jelzik. Először tekintsük a felső képet; ez az oszlopot ábrázolja a nulla időpontban , amikor a minta belép az oszlopba és elkezd sávot képezni. Az itt látható minta, egy sárga, vörös és kék színezékek keveréke, egyetlen fekete sávként jelenik meg az oszlop bemeneténél.
Néhány perc elteltével , amely alatt a mobilfázis folyamatosan és egyenletesen áramlik a töltőanyag részecskéi mellett, láthatjuk, hogy az egyes festékek külön sávokban, különböző sebességgel mozognak. Ez azért van, mert a mobilfázis és az állófázis között verseny van az egyes festékek vagy analitok vonzásáért. Vegyük észre, hogy a sárga színezősáv mozog a leggyorsabban, és hamarosan kilép az oszlopból. A sárga festék jobban szereti a mozgófázist, mint a többi festék. Ezért gyorsabban mozog, közelebb a mozgófázishoz. A kék színezősáv jobban szereti a csomagolóanyagot, mint a mozgófázist. A részecskékhez való erősebb vonzódása miatt lényegesen lassabban mozog. Más szóval, ez a leginkább visszatartott vegyület ebben a mintakeverékben. A vörös színezősáv köztes vonzódást gyakorol a mozgófázishoz, ezért köztes sebességgel mozog az oszlopon keresztül. Mivel az egyes festéksávok eltérő sebességgel mozognak, kromatográfiásan el tudjuk választani őket egymástól.
G ábra: A kromatográfiás oszlop működésének megértése – sávok
Mi a detektor?
Amint az elválasztott festéksávok elhagyják az oszlopot, azonnal a detektorba jutnak. A detektor egy áramlási cellát tartalmaz, amely minden egyes elválasztott vegyületsávot lát a mobilfázis hátterével szemben . A megfelelő detektor képes érzékelni egy vegyület jelenlétét, és a megfelelő elektromos jelet elküldeni egy számítógépes adatállomásnak. Az elválasztandó és elemzendő vegyületek jellemzőitől és koncentrációjától függően számos különböző típusú detektor közül lehet választani, amint azt korábban már tárgyaltuk.
Mi a kromatogram?
A kromatogram a HPLC-rendszerben kémiailag megtörtént elválasztás ábrázolása. Egy időtengelyen egy alapvonalról emelkedő csúcsok sorozata rajzolódik ki. Minden csúcs egy másik vegyület detektorválaszát jelöli. A kromatogramot a számítógépes adatállomás rajzolja ki .
H ábra: A csúcsok keletkezése
A H ábrán a sárga sáv teljesen áthaladt a detektor áramlási celláján; a keletkezett elektromos jelet a számítógépes adatállomáshoz küldték. Az így kapott kromatogram elkezdett megjelenni a képernyőn. Vegyük észre, hogy a kromatogram a minta első befecskendezésekor kezdődik, és a képernyő aljához közeli egyenes vonalként indul. Ezt nevezzük alapvonalnak; ez az áramlási cellán idővel áthaladó tiszta mozgófázist jelenti. Ahogy a sárga elemzősáv áthalad az áramlási cellán, egyre erősebb jelet küld a számítógépnek. A vonal először felfelé, majd lefelé görbül, a mintasávban lévő sárga festék koncentrációjának arányában. Ez egy csúcsot hoz létre a kromatogramon. Miután a sárga sáv teljesen áthalad a detektorcellán, a jelszint visszatér az alapvonalra; az áramlási cellában most ismét csak tiszta mozgófázis van. Mivel a sárga sáv mozog a leggyorsabban, elsőként eluálódik ki az oszlopból, ez az első kirajzolódó csúcs.
Kicsivel később a piros sáv eléri az áramlási cellát. A jel az alapvonalról felemelkedik, amikor a piros sáv először belép a cellába, és a piros sávot képviselő csúcs kezd kirajzolódni. Ezen az ábrán a piros sáv még nem haladt át teljesen az áramlási cellán. A diagram azt mutatja, hogyan nézne ki a vörös sáv és a vörös csúcs, ha ebben a pillanatban megállítanánk a folyamatot. Mivel a vörös sáv nagy része áthaladt a cellán, a csúcs nagy része is kirajzolódott, amint azt a folytonos vonal mutatja. Ha újra tudnánk indítani, a piros sáv teljesen áthaladna az áramlási cellán, és a piros csúcs befejeződne . A kék sáv, a legerősebben visszatartott, a leglassabban halad, és a piros sáv után eluálódik. A szaggatott vonal mutatja, hogyan nézne ki a befejezett kromatogram, ha hagytuk volna, hogy a futás a végéig folytatódjon. Érdekes megjegyezni, hogy a kék csúcs szélessége lesz a legszélesebb, mert a kék analit sáv szélessége, míg az oszlopon a legkeskenyebb, az oszlopról való eluálás során a legszélesebbé válik. Ez azért van így, mert lassabban mozog a kromatográfiás csomagolóanyag-ágyon keresztül, és több időre van szüksége a teljes eluáláshoz. Mivel a mobilfázis folyamatosan, rögzített sebességgel áramlik, ez azt jelenti, hogy a kék sáv kiszélesedik és hígabbá válik. Mivel a detektor a sáv koncentrációjával arányosan reagál, a kék csúcs magassága kisebb, szélessége viszont nagyobb.