Enzimkatalízis

Ezek a konformációs változások az aktív központban lévő katalitikus maradékokat is közel hozzák a szubsztrátban lévő kémiai kötésekhez, amelyek a reakció során megváltoznak. Miután a kötés megtörtént, a katalízis egy vagy több mechanizmusa csökkenti a reakció átmeneti állapotának energiáját azáltal, hogy alternatív kémiai utat biztosít a reakcióhoz. A “gáton túli” katalízisnek hat lehetséges mechanizmusa van, valamint egy “gáton keresztüli” mechanizmus:

Közelség és orientációSzerkesztés

Az enzim-szubsztrát kölcsönhatások összehangolják a reaktív kémiai csoportokat, és optimális geometriában, egymáshoz közel tartják őket, ami növeli a reakció sebességét. Ez csökkenti a reaktánsok entrópiáját, és így az addíciós vagy transzferreakciókat kevésbé kedvezőtlenné teszi, mivel csökken a teljes entrópia, amikor két reaktánsból egyetlen termék lesz. Ez azonban egy általános hatás, és a nem addíciós vagy transzfer reakciókban is megfigyelhető, ahol a reagensek “effektív koncentrációjának” növekedése miatt következik be. Ezt akkor értjük meg, ha megvizsgáljuk, hogy a koncentráció növekedése hogyan vezet a reakciósebesség növekedéséhez: lényegében amikor a reaktánsok nagyobb koncentrációban vannak, gyakrabban ütköznek, és így gyakrabban reagálnak. Az enzimkatalízisben a reagenseknek az enzimhez való kötődése korlátozza a reaktánsok konformációs terét, a “megfelelő orientációban” és egymáshoz közel tartja őket, így azok gyakrabban és a megfelelő geometriával ütköznek, hogy elősegítsék a kívánt reakciót. Az “effektív koncentráció” az a koncentráció, amelyet a reaktánsnak szabadon, oldatban kellene elérnie ahhoz, hogy ugyanazt az ütközési gyakoriságot tapasztalja. Gyakran az ilyen elméleti effektív koncentrációk nem fizikaiak, és a valóságban lehetetlen megvalósítani őket – ami sok enzim nagy katalitikus erejéről tanúskodik, a katalizálatlan állapothoz képest hatalmas sebességnövekedéssel.

Például:

A hasonló reakciók sokkal gyorsabban mennek végbe, ha a reakció intramolekuláris.

Az intramolekuláris reakcióban az acetát hatékony koncentrációja k2/k1 = 2 x 105 molárisra becsülhető.

A helyzet azonban ennél összetettebb lehet, mivel a modern számításos vizsgálatok megállapították, hogy a közelségi hatások hagyományos példái nem kapcsolhatók közvetlenül az enzim entrópikus hatásaihoz. Emellett az eredeti entrópiai javaslatról kiderült, hogy nagymértékben túlbecsüli az orientációs entrópia hozzájárulását a katalízishez.

Proton donorok vagy akceptorokSzerkesztés

Proton donorok és akceptorok, azaz a savak és bázisok protonokat adhatnak és fogadhatnak el, hogy stabilizálják a fejlődő töltéseket az átmeneti állapotban. Ez összefügg a katalízis általános elvével, az energiagátak csökkentésével, mivel az átmeneti állapotok általában nagy energiájú állapotok, és stabilizálásukkal ez a nagy energia csökken, csökkentve ezzel a gátat. Az enzimkatalízis egyik legfontosabb jellemzője számos nem biológiai katalízissel szemben az, hogy a sav- és báziskatalízis kombinálható ugyanabban a reakcióban. Sok abiotikus rendszerben a savak (nagy ) vagy bázisok ( nagy koncentrációjú H+ -nyelők, vagy elektronpárokkal rendelkező fajok) növelhetik a reakció sebességét; de természetesen a környezetnek csak egy általános pH-ja lehet (a savasság vagy bázicitás (lúgosság) mértéke). Mivel azonban az enzimek nagy molekulák, aktív helyükön mind savas, mind bázikus csoportokat képesek elhelyezni a szubsztrátjaikkal való kölcsönhatás érdekében, és mindkét módot az alap-pH-tól függetlenül alkalmazzák.

Az általános savas vagy bázikus katalízist gyakran nukleofil és/vagy elektrofil csoportok aktiválására, illetve a távozó csoportok stabilizálására alkalmazzák. Számos savas vagy bázikus csoporttal rendelkező aminosavat alkalmaznak ilyen módon az aktív centrumban, például a glutaminsavat és az aszparaginsavat, a hisztidint, a cisztint, a tirozint, a lizint és az arginint, valamint a szerint és a treonint. Ezenkívül gyakran alkalmazzák a peptidgerincet, karbonil és amid N-csoportokkal. A cisztin és a hisztidin nagyon gyakran érintett, mivel mindkettő pKa értéke közel van a semleges pH-értékhez, és ezért mind protonokat felvehetnek, mind pedig leadhatnak.

Sok sav/bázis katalízissel járó reakciómechanizmus jelentősen megváltozott pKa értéket feltételez. A pKa e megváltozása a maradék helyi környezetén keresztül lehetséges.

Feltételek	Savak	Bázisok
Hidrofób környezet	Növeli a pKa-t	csökkenti a pKa-t
Hasonló töltésű szomszédos maradékok	növeli a pKa-t. pKa	csökken pKa
Sóhíd (és hidrogén kötés) kialakulása	csökken pKa	Növekszik pKa

A pKa-t a környezet is jelentősen befolyásolhatja, olyan mértékben, hogy olyan maradékok, amelyek oldatban bázikusak, protondonorként viselkedhetnek, és fordítva.

Példa:

A szerinproteáz katalitikus hármasa

A szerinproteáz katalitikus mechanizmusának kezdeti lépése során az aktív centrum hisztidinje egy protont fogad el a szerinmaradéktól. Ezáltal a szerin nukleofilként felkészül a szubsztrát amidkötésének megtámadására. Ez a mechanizmus magában foglalja a proton donációját a szerinről (bázis, pKa 14) a hisztidinre (sav, pKa 6), amit a bázisok helyi környezete tesz lehetővé.

Nagyon fontos tisztázni, hogy a pKa-k módosulása az elektrosztatikus mechanizmus tiszta része. Továbbá a fenti példa katalitikus hatása elsősorban az oxianion pKa értékének csökkenéséhez és a hisztidin pKa értékének növekedéséhez kapcsolódik, míg a szerinről a hisztidinre történő protonátvitel nem katalizálódik jelentősen, mivel nem ez a sebességet meghatározó gát.

Elektrosztatikus katalízisSzerkesztés

A töltött átmeneti állapotok stabilizálása történhet úgy is, hogy az aktív centrumban lévő maradékok ionos kötéseket (vagy részleges ionos töltéskölcsönhatásokat) képeznek az intermedierrel. Ezek a kötések származhatnak az aminosavak, például lizin, arginin, aszparaginsav vagy glutaminsav savas vagy bázikus oldalláncaiból, vagy fém kofaktorokból, például cinkből. A fémionok különösen hatékonyak, és képesek a víz pKa értékét eléggé csökkenteni ahhoz, hogy hatékony nukleofillá váljon.

Szisztematikus számítógépes szimulációs vizsgálatok megállapították, hogy az elektrosztatikus hatások messze a legnagyobb mértékben járulnak hozzá a katalízishez. Ez akár 107-szeresére is növelheti a reakció sebességét. Különösen azt találták, hogy az enzim a víznél polárisabb környezetet biztosít, és az ionos átmeneti állapotokat fix dipólusok stabilizálják. Ez nagyban különbözik a vízben lévő átmeneti állapotok stabilizációjától, ahol a vízmolekuláknak “átrendeződési energiával” kell fizetniük. Az ionos és töltött állapotok stabilizálása érdekében. A katalízis tehát azzal függ össze, hogy az enzim poláris csoportjai előreszerveződnek

Az enzim aktív helyén kifejtett elektrosztatikus mező nagysága bizonyítottan erősen korrelál az enzim katalitikus sebességének fokozásával

A szubsztrát megkötése általában kizárja a vizet az aktív helyről, ezáltal a helyi dielektromos állandó a szerves oldószerére csökken. Ez erősíti az elektrosztatikus kölcsönhatásokat a töltött/poláris szubsztrátok és az aktív helyek között. Emellett a vizsgálatok kimutatták, hogy az aktív helyek körüli töltéseloszlások úgy rendeződnek, hogy stabilizálják a katalizált reakciók átmeneti állapotait. Számos enzimben ezek a töltéseloszlások nyilvánvalóan arra szolgálnak, hogy a poláris szubsztrátokat a kötőhelyeik felé irányítsák, így ezen enzimatikus reakciók sebessége nagyobb, mint a látszólagos diffúzióvezérelt határértékek.

Például:

Karboxi-peptidáz katalitikus mechanizmusa

A tetraéderes köztiterméket a Zn2+ ion és az oxigén negatív töltése közötti részleges ionos kötés stabilizálja.

Kovalens katalízisSzerkesztés

A kovalens katalízis során a szubsztrát átmeneti kovalens kötést képez az enzim aktív helyén lévő maradékokkal vagy egy kofaktorral. Ez egy további kovalens intermedierrel egészíti ki a reakciót, és segít csökkenteni a reakció későbbi átmeneti állapotainak energiáját. A kovalens kötést a reakció egy későbbi szakaszában fel kell bontani az enzim regenerálásához. Ezt a mechanizmust használja az enzimek katalitikus triádja, például az olyan proteázok, mint a kimotripszin és a tripszin, ahol egy acil-enzim intermedier keletkezik. Egy alternatív mechanizmus a lizinmaradvány szabad aminjának felhasználásával történő schiff-bázisképződés, ahogyan azt a glikolízis során az aldoláz enzimnél láthatjuk.

Néhány enzim nem aminosav kofaktort, például piridoxálfoszfátot (PLP) vagy tiamin-pirofoszfátot (TPP) használ, hogy kovalens intermediereket képezzen a reagáló molekulákkal. Az ilyen kovalens intermedierek a későbbi átmeneti állapotok energiájának csökkentésére szolgálnak, hasonlóan ahhoz, ahogyan az aktív hely aminosav-maradványaival képződött kovalens intermedierek stabilizálást tesznek lehetővé, de a kofaktorok képességei lehetővé teszik az enzimek számára, hogy olyan reakciókat hajtsanak végre, amelyeket az aminosav-oldalmaradványok önmagukban nem tudnának. Az ilyen kofaktorokat használó enzimek közé tartozik a PLP-függő aszpartát-transzamináz enzim és a TPP-függő piruvát-dehidrogenáz enzim.

A kovalens katalízis a reakcióút aktiválási energiájának csökkentése helyett alternatív útvonalat biztosít a reakcióhoz (a kovalens köztiterméken keresztül), és így különbözik a valódi katalízistől. Például a kimotripszinben a szerinmolekulához való kovalens kötés energetikáját össze kell hasonlítani a nukleofilhez való jól ismert kovalens kötéssel a nem katalizált oldatreakcióban. A kovalens katalízis valódi javaslatához (ahol a gát alacsonyabb, mint az oldatban lévő megfelelő gát) például egy enzimcsoportnak az átmeneti állapothoz való részleges kovalens kötése (pl. egy nagyon erős hidrogénkötés) lenne szükséges, és az ilyen hatások nem járulnak hozzá jelentősen a katalízishez.

Fémion-katalízisSzerkesztés

A fémion az aktív centrumban a töltésstabilizálás és árnyékolás koordinálásával vesz részt a katalízisben. A fém pozitív töltése miatt a fémionok révén csak negatív töltések stabilizálhatók. A fémionok azonban előnyösek a biológiai katalízisben, mert a pH-változások nem befolyásolják őket. A fémionok Lewis-savként viselkedve a víz ionizálására is képesek. A fémionok lehetnek oxidációs és redukciós ágensek is.

KötésfeszültségSzerkesztés

Ez az indukált illeszkedési kötés fő hatása, amikor az enzim affinitása az átmeneti állapothoz nagyobb, mint magához a szubsztráthoz. Ez olyan szerkezeti átrendeződéseket indukál, amelyek a szubsztrátkötéseket az átmeneti állapot konformációjához közelebbi helyzetbe feszítik, így csökkentve a szubsztrát és az átmeneti állapot közötti energiakülönbséget, és segítve a reakció katalizálását.

A feszítési hatás azonban valójában inkább alapállapot-destabilizációs hatás, mint átmeneti állapot-stabilizációs hatás. Ráadásul az enzimek nagyon rugalmasak, és nem tudnak nagy törzshatást alkalmazni.

A szubsztrátban lévő kötéstörzs mellett magában az enzimben is előidézhető kötéstörzs az aktív centrumban lévő maradékok aktiválása érdekében.

Példa:

A lizozim szubsztrát, kötött szubsztrát és átmeneti állapot konformációja.

A szubsztrát, a kötődéskor, a hexózgyűrű félszéki konformációjából (a fehérje aminosavai által okozott sztérikus akadályok miatt, amelyek az egyenlítői c6-ot axiális helyzetbe kényszerítik) a széki konformációba torzul

Kvantum-alagutazásSzerkesztés

A hagyományos “akadályon túli” mechanizmusokat néhány esetben megkérdőjelezték a “akadályon átívelő” mechanizmusok (kvantum-alagutazás) modelljei és megfigyelései. Egyes enzimek olyan kinetikával működnek, amely gyorsabb, mint amit a klasszikus ΔG‡ megjósolna. A “gáton átvezető” modellekben egy proton vagy egy elektron át tud alagutatni az aktivációs gátakon. A protonok kvantum-alagutazását megfigyelték az aromás amin-dehidrogenáz által végzett triptamin-oxidációban.

A kvantum-alagutazás nem tűnik jelentős katalitikus előnynek, mivel a katalizált és a nem katalizált reakciókban az alagutas hozzájárulások hasonlóak az oldatban. Azonban az alagutas hozzájárulás (amely jellemzően ~1000-szeresére növeli a sebességállandókat a klasszikus “akadályon túli” útvonal reakciósebességéhez képest) valószínűleg döntő fontosságú a biológiai organizmusok életképessége szempontjából. Ez hangsúlyozza az alagutas reakciók általános jelentőségét a biológiában.

1971-1972-ben fogalmazták meg az enzimkatalízis első kvantummechanikai modelljét.

Aktív enzimSzerkesztés

Az enzim-szubsztrát komplex kötési energiája nem tekinthető a szubsztrát aktiválásához szükséges külső energiának. A nagy energiatartalmú enzim először az enzim katalitikus helyéről valamilyen specifikus X1 energetikai csoportot vihet át az első kötött reaktáns végső helyére, majd a második kötött reaktánsból (vagy az egyetlen reaktáns második csoportjából) egy másik X2 csoportot kell átvinni az aktív helyre a szubsztrát termékké alakításának befejezéséhez és az enzim regenerációjához.

A teljes enzimatikus reakciót két kapcsolási reakcióként is ábrázolhatjuk:

S 1 + EX 1 ⟶ S 1 EX 1 ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EX1 -> S1EX1 -> {P1}+ EP2}}}})

(1)

S 2 + EP 2 ⟶ S 2 EP 2 ⟶ P 2 + EX 2 {\displaystyle {\ce {{S2}+ EP2 -> S2EP2 -> {P2}+ EX2}}}}

(2)

Az (1) reakcióból látható, hogy az aktív enzim X1 csoportja megjelenik a termékben az enzimen belüli cserereakció lehetősége miatt, hogy elkerüljük mind az elektrosztatikus gátlást, mind az atomok taszítását. Az aktív enzimet tehát az enzimatikus reakció erőteljes reagenseként ábrázoljuk. A (2) reakció a szubsztrát nem teljes átalakulását mutatja, mivel X2 csoportja az enzimben marad. Ezt a megközelítést, mint ötletet korábban a feltételezett rendkívül magas enzimatikus konverzióra (katalitikusan tökéletes enzim) támaszkodva javasolták.

A jelen megközelítés igazolása szempontjából döntő fontosságú, hogy a katalizátornak az enzimnek a reakció transzfercsoportjával alkotott komplexnek kell lennie. Ezt a kémiai szempontot számos enzimatikus reakció jól tanulmányozott mechanizmusa támasztja alá. Tekintsük a peptidkötés hidrolízisének reakcióját, amelyet a tiszta fehérje α- kimotripszin (kofaktor nélkül ható enzim) katalizál, amely a szerin proteázok családjának jól tanulmányozott tagja, ld.

Az erre a reakcióra vonatkozó kísérleti eredményeket két kémiai lépésként mutatjuk be:

S 1 + EH ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EH -> {P1}+ EP2}}}}}

(3)

EP 2 + H – O – H ⟶ EH + P 2 {\displaystyle {\ce {{EP2}+ {H-O-H}-> {EH}+ P2}}}}

(4)

ahol S1 egy polipeptid, P1 és P2 termékek. Az első kémiai lépés (3) egy kovalens acil-enzim intermedier képződését foglalja magában. A második lépés (4) a deacilálási lépés. Fontos megjegyezni, hogy a H+ csoport, amely eredetileg az enzimen, de nem a vízben található, a hidrolízis lépése előtt jelenik meg a termékben, ezért az enzimatikus reakció további csoportjának tekinthető.

A (3) reakció tehát azt mutatja, hogy az enzim a reakció erőteljes reagenseként működik. A javasolt koncepció szerint az enzim H-transzportja elősegíti az első reaktáns átalakulását, az első kezdeti kémiai kötés (a P1 és P2 csoportok között) lebontását. A hidrolízis lépése a második kémiai kötés lebontásához és az enzim regenerációjához vezet.

A javasolt kémiai mechanizmus nem függ a szubsztrátok vagy a termékek koncentrációjától a közegben. Koncentrációjuk eltolódása azonban elsősorban az (1) és (2) reakciók első és utolsó lépésében okoz szabadenergia-változást, ami minden molekula – legyen az S vagy P – szabad energiatartalmának változásából adódik a vizes oldatban. ez a megközelítés összhangban van az izomösszehúzódás alábbi mechanizmusával. A vázizomzatban az ATP-hidrolízis utolsó lépése a miozinfejek aktinnal való társulása által okozott termékfelszabadulás. Az aktinkötő hasadék záródása az asszociációs reakció során szerkezetileg összekapcsolódik a miozin aktív helyén lévő nukleotidkötő zseb megnyitásával.

Az ATP-hidrolízis végső lépései közé tartozik a foszfát gyors és az ADP lassú felszabadulása.A foszfát anion felszabadulása a kötött ADP anionból a vízoldatba exergonikus reakciónak tekinthető, mivel a foszfát anion kis molekulatömeggel rendelkezik.

Így arra a következtetésre jutunk, hogy a szervetlen foszfát H2PO4- elsődleges felszabadulása az ATP-hidrolízis szabad energiájának jelentős részének az oldott foszfát kinetikai energiájává történő átalakulásához vezet, aktív áramlást eredményezve. A lokális mechanokémiai transzdukciónak ez a feltételezése összhangban van Tirosh izomösszehúzódási mechanizmusával, ahol az izomerő az ATP-hidrolízis által létrehozott aktív áramlás integrált hatásából származik.