Diagnosis of Legionella Infection

Abstract

A legionellákat, amelyek az emberi tüdőgyulladás fontos okozói, továbbra is helytelenül egzotikus kórokozóknak bélyegzik. A Legionella-fertőzés diagnosztizálásának képességét a klinikai jellemzők nem specifikus jellege és a diagnosztikai tesztek hiányosságai korlátozzák. A közelmúltbeli fejlesztések ellenére a Legionella-fertőzésre vonatkozó meglévő diagnosztikai tesztek vagy nem elég érzékenyek az összes klinikailag fontos legionella kimutatására, vagy nem képesek klinikailag hasznos időn belül eredményt szolgáltatni. A helyi Legionella-epidemiológia megértése fontos a Legionella-fertőzés vizsgálatának szükségességéről és az alkalmazandó diagnosztikai tesztekről szóló döntések meghozatalához. A legtöbb esetben a vizeletantigén-teszt és a köpettenyésztés együttes alkalmazása a legjobb diagnosztikai kombináció. A polimeráz láncreakció (PCR) ígéretes eszköz, de a kereskedelemben nem állnak rendelkezésre szabványosított tesztek. A további munkának a patogén legionellák szélesebb körét kimutató vizeletantigén-tesztek, valamint a standardizált PCR-tesztek kifejlesztésére kell összpontosítania.

A legionárius betegség továbbra is egzotikus fertőzés hírében áll. Ezzel szemben, ha szisztematikusan keresik, a Legionella fajokat következetesen a tüdőgyulladás egyik gyakori okozójaként ismerik fel. A kutatási környezeten kívül azonban a legionellózis megerősített diagnózisa ritkán fordul elő. A legionárius betegség rutinszerű diagnosztizálásának elmulasztása nagyrészt 3 tényező eredménye: a legionárius betegség klinikai és radiológiai megkülönböztetésének képtelensége a tüdőgyulladás más okaitól, a Legionella-fertőzés diagnosztikai vizsgálatának elmulasztása, valamint a rendelkezésre álló diagnosztikai vizsgálatok hiányosságai. A legionárius betegséget pontosabban jellemezhetjük úgy, mint egy megfoghatatlan diagnózist, mint egy egzotikus fertőzést.

Noha a diagnosztikai módszerek fejlődtek a Legionella pneumophila első leírása óta eltelt 25 év alatt, egyetlen jelenleg rendelkezésre álló teszt sem képes a legionárius betegség időben történő, nagyfokú érzékenységgel és specificitással történő diagnosztizálására. Sőt, egyes szerzők megkérdőjelezték a tüdőgyulladásban szenvedő betegek bármilyen mikrobiológiai vizsgálatának rutinszerű elrendelését, amit alátámasztanak azok az adatok, amelyek szerint az ilyen vizsgálatok nem befolyásolják jelentősen az antibiotikum-terápia megválasztását és a beteg kimenetelét . Nemrégiben Marrie azzal érvelt, hogy a legionárius betegség diagnózisának ez a megközelítése helytelen. A Legionella-fertőzés vizsgálatának elmulasztása késleltetheti a legionárius betegség kitörésének felismerését, elszalaszthatja a betegség epidemiológiájában bekövetkező változásokat (beleértve az antimikrobiális rezisztencia kialakulását), és megakadályozhatja, hogy a személyek kártérítést igényeljenek a foglalkozás során szerzett fertőzés miatt. Fontos, hogy ki lehet választani a betegek azon alcsoportját, akik esetében a Legionella-fertőzés diagnosztikai vizsgálatainak hozama magas, és akik számára előnyös lenne egy specifikus diagnózis.

Ez az áttekintés a Legionella-fertőzés jelenlegi diagnosztikai vizsgálataira összpontosít, különös hangsúlyt fektetve azokra a vizsgálatokra, amelyek olyan időkeretben adnak diagnózist, amely befolyásolja a fertőzés kezdeti kezelését. A Legionella-fertőzés különböző diagnosztikai tesztjeinek áttekintése során fontos szem előtt tartani számos tényezőt. Először is, a Legionella-fertőzés diagnosztizálásához speciális vizsgálatokra van szükség, és ezeket a klinikusnak kifejezetten kérnie kell. Másodszor, fontos, hogy értékeljük a különbséget egy tesztnek egy kutatólaboratóriumban történő elvégzése és a helyi diagnosztikai laboratóriumban reálisan elérhető teljesítménye között. A legionellák tenyésztési képessége tekintetében jelentős laboratóriumok közötti eltéréseket dokumentáltak, és ez valószínűleg más tesztekre is kiterjed. Harmadszor, a diagnosztikai tesztek teljesítményének értelmezését akadályozza a megfelelő “arany standard” hiánya. A kiszámított érzékenységi és specificitási adatok különböző összehasonlítási standardok esetén eltérőek. Negyedszer, a diagnosztikai tesztek hasznosságát befolyásolja a helyi Legionella-epidemiológia. Az L. pneumophila 1. szerocsoportja a legionellózis uralkodó okozója a világ számos, ha nem a legtöbb területén, és az ezzel az organizmussal való fertőzést könnyebb diagnosztizálni, mint a többi Legionella fajjal és szerocsoporttal való fertőzést. Egyes régiókban más fajok és szerocsoportok fontosabbak. Például a Legionella longbeachae a legionellózis egyik fő okozója Ausztráliában és Új-Zélandon , ahol gyakran összefüggésbe hozható a virágkeverékkel való érintkezéssel. Az ezzel a fajjal való fertőzés a jelenlegi vizeletantigén-tesztekkel nem mutatható ki, és a csak L. pneumophila szerológiai vizsgálatát végző laboratóriumok nem veszik észre.

Kultúra

A kultúrdiagnosztika speciális táptalajt, a minták megfelelő feldolgozását és technikai szakértelmet igényel (1. táblázat). A pozitív eredmény eléréséhez több napra van szükség, a legtöbb Legionella-kolóniát 3-5 napon belül lehet kimutatni. A legionellák tenyésztésére használt standard táptalaj a pufferelt szén-élesztőkivonat (BCYE) agar, α-ketoglutaráttal kiegészítve, antimikrobiális szerekkel vagy anélkül. Ez a táptalaj vasat és L-ciszteint biztosít, amelyek mindkettő nélkülözhetetlen a legionellák növekedéséhez. Egyes Legionella fajok (pl. Legionella micdadei és Legionella bozemanii) növekedését fokozza a BCYE-agar szarvasmarha-szérumalbuminnal való kiegészítése, és az indikátorfestékek hozzáadása a táptalajhoz segítheti az azonosítást. A cefamandolt tartalmazó táptalajok gátolják a β-laktamázt nem termelő Legionella fajok, például az L. micdadei és az L. bozemanii növekedését .

A Legionellák számos mintatípusból izolálhatók, bár az alsó légúti váladékok (pl., köpet és hörgőtükrözésből származó minták) a legmegfelelőbb minták. A köpettenyésztés fő korlátja, hogy a legionárius betegségben szenvedő betegek kevesebb mint fele termel köpetet . Egyéb tényezők is befolyásolják a tenyésztés érzékenységét, miután köpetmintát nyertek. A légúti váladékban a legionella baktériumok nehezen élnek túl, és ezeket a mintákat azonnal fel kell dolgozni. A legionárius betegségben szenvedő betegek egy része viszonylag kevés gennyes köpetet termel; ezeket a mintákat a kevés polimorfonukleáris leukocitát tartalmazó köpetmintákat selejtező laboratóriumok elutasíthatják. Következésképpen a Legionella tenyésztésre küldött köpetmintákra nem szabad visszautasítási kritériumokat alkalmazni. A laboratóriumi személyzet tapasztalata is fontos, és a Legionella tenyésztésben tapasztalt laboratóriumok nagyobb valószínűséggel nyerik ki a szervezetet.

A köpettenyésztés becsült érzékenysége <10% és ∼80% között mozog, és a különböző összehasonlító standardok és az egyes laboratóriumok szerint változik. A gyakorlatban a jobb eredményeket valószínűleg csak a Legionella-fertőzésben különösen érdekelt laboratóriumok érik el, és az érzékenységek általában <50%, ha a szerológiai leleteket használják standardként. A bronchoszkópos minták valószínűleg nagyobb diagnosztikus hozamot eredményeznek, mint a köpetminták.

Vértenyészetből is izolálhatók Legionella fajok, de a hozam gyenge. A legionellák növekedését a rutin vértenyésztő közegek fenntartják, de nem biztos, hogy aktiválják a kereskedelmi vértenyésztő gépek riasztását . Következésképpen vak szubkultúrákra van szükség szilárd táptalajon. Összességében a vértenyészetek hozama alacsony, és nem valószínű, hogy befolyásolja a klinikai kezelést.

Direkt fluoreszcens antitest (Dfa) festés

ADFA festéssel kimutathatók a legionellák a légúti váladékban és a szövetmintákban. Ennek a technikának az az előnye, hogy 2-4 órán belül eredményt ad, de technikailag igényes, és tapasztalt laboratóriumi személyzetnek kell elvégeznie. A DFA-festés jelentett érzékenysége változó, következetesen kisebb, mint a tenyésztésé, és az L. pneumophilától eltérő fajok esetében kevésbé ismert. Az alsó légúti váladékok esetében az érzékenység általában 25%-66% között mozog, a bronchoalveoláris lavage folyadékminták nagyobb hozammal rendelkeznek, mint a transtracheális vagy a köpetminták. A DFA-festés specificitása a becslések szerint ∼94% , bár a teszt tapasztalatlan kezekben valószínűleg kevésbé specifikus. Más baktériumokkal, többek között a Bacteroides fragilis, a Pseudomonas fajok, a Stenotrophomonas fajok és a Flavobacterium fajok keresztreakciója miatt téves pozitív eredmények adódhatnak. A keresztreakciók kisebb problémát jelenthetnek, ha monoklonális antitest DFA szereket használnak. Az érzékenységgel és a specificitással kapcsolatos problémák korlátozták a DFA-festés alkalmazását, és a pozitív DFA-eredményt más alátámasztó bizonyíték hiányában ma már általában nem fogadják el elegendőnek a Legionella-fertőzés diagnózisához.

Húgyúti antigén kimutatása

A szolubilis Legionella-antigén kimutatása a vizeletmintákban gyors módszer, amely a Legionella-fertőzés korai diagnózisát biztosítja, és hasznos eszköznek bizonyult a Legionnaires-betegség kitöréseinek vizsgálatában . Az RIA- és EIA-módszereket egyaránt alkalmazó kereskedelmi készletek már évek óta kaphatók, és hasonló teljesítményjellemzőkkel rendelkeznek. Nemrégiben kifejlesztettek egy immunkromatográfiás vizsgálatot (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax), amely az EIA-hoz hasonló érzékenységgel és specificitással rendelkezik. Ez a teszt könnyen elvégezhető, és 15 percen belül eredményt adhat.

A L. pneumophila 1. szerocsoport kimutatására a vizelet antigén tesztek 70-100% közötti érzékenységgel és 100%-ot megközelítő specificitással rendelkeznek. A vizeletminták vizsgálat előtti 25-szörös koncentrálásával az érzékenység akár 20%-kal is növelhető . E tesztek fő hátránya, hogy nem képesek megbízhatóan kimutatni az L. pneumophila 1. szerocsoportjától eltérő organizmusokat. Kifejlesztettek széles spektrumú teszteket, amelyek a Legionella fajok széles köréből származó oldható antigéneket mutatják ki, de kereskedelmi forgalomban nem kaphatók. A Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) az L. pneumophila 1. szerocsoporttól eltérő legionellák kimutatására szolgál, de ezt kevésbé megbízhatóan teszi, mint az L. pneumophila 1. szerocsoport kimutatását. A szérumbetegségben szenvedő betegeknél előfordultak téves pozitív vizelet-antigén eredmények .

A legionella antigenuria már a tünetek megjelenése után 1 nappal kimutatható, és napokig vagy hetekig fennáll. Egy esetben dokumentálták, hogy az antigén kiválasztása >300 napig tartott . Oldható Legionella antigéneket mutattak ki a vizelettől eltérő mintákban is, beleértve a köpetből, tüdőszövetből, szérumból és pleurális folyadékból vett mintákat, bár az ilyen minták felhasználását még nem értékelték teljes mértékben.

A vizelet antigén vizsgálata ma már bevett és értékes eszköz a legionárius betegség diagnózisában, különösen azokban a régiókban, ahol az L. pneumophila 1. szerocsoportja a betegség leggyakoribb okozója. Azokon a helyeken, ahol a fertőzéseknek csak kisebb részét okozza az L. pneumophila 1. szerocsoportja, a jelenleg rendelkezésre álló vizeletantigén-tesztek kevésbé járulnak hozzá a meglévő laboratóriumi vizsgálatokhoz.

Serológiai vizsgálat

A Legionella-fertőzés szerológiai vizsgálata értékes járványügyi eszköz, de a klinikai döntéshozatalra kevés hatással van, mivel az eredmény rendelkezésre állását megelőző időbeli késedelem miatt. A fertőzésre válaszul termelődő antitestek általában IgA, IgM és IgG keverékei, és a teszteknek az optimális érzékenység érdekében minden típust ki kell mutatniuk. A specifikus IgM mérése az akut fertőzés megbízhatatlan markere, mivel az IgM antitestek hosszú ideig fennmaradhatnak. A szerokonverzió több hétig is eltarthat, ami a szerológiai vizsgálatok egyik fő korlátja. A legtöbb esetben az antitesttiter 4-szeres növekedése 3-4 héten belül kimutatható, de egyes esetekben ez >10 hétig is eltarthat . A lábadozási fázisban lévő szérumminták túl korai beszerzése kétségtelenül sok hamis-negatív eredményt eredményez, és valószínűleg részben magyarázatot ad a legionárius betegségben szenvedő betegek 20-30%-ára, akiknél állítólag nem alakul ki kimutatható antitestválasz . Egyértelmű azonban, hogy a bizonyítottan Legionella-fertőzöttek egy részénél nem mutatható ki a szerokonverzió . A gyakorlatban a klinikusokat arra kell ösztönözni, hogy a betegség kezdete után 3 héttel a lábadozó fázisban lévő szérummintákat vegyenek a vizsgálathoz, az akut fázisban nyert szérummal párhuzamosan. Ha ezen időszak után sem történik szerokonverzió, és továbbra is fennáll a Legionella-fertőzés gyanúja, további lábadozó fázisú mintát kell venni.

A rendelkezésre álló különböző antitest-kimutatási módszerek közül az indirekt immunfluoreszcencia a standard referenciateszt. A ⩾128 elleni reciprok antitesttiter 4-szeres vagy nagyobb növekedése diagnosztikusnak tekinthető. Az akut fázisú ⩾256 reciprok antitesttitereket tüdőgyulladás jelenlétében egykor elegendőnek tartották a feltételezett diagnózishoz, de ez megbízhatatlannak bizonyult, különösen a Legionella-antitest-pozitivitás nagy gyakoriságát tekintve egyes személyek körében, akiknél a legionellózis klinikai jelei nem mutatkoznak. Az egyszeri szérumminták vizsgálatának gyakorlatilag nincs szerepe.

A szerológiai vizsgálat másik hátránya, hogy nem képes pontosan kimutatni az összes Legionella-fajt és szerocsoportot. Bár az L. pneumophila 1. szerocsoportjával szembeni szerokonverziót általában úgy tekintik, hogy az erősen előrejelzi a betegséget, a más fajokkal és szerocsoportokkal szembeni szerokonverzió érzékenységét és specificitását nem erősítették meg szigorúan. Továbbá a Legionellaceae család tagjai közötti keresztreaktív antitestképződés megnehezítheti a fertőző faj vagy szerocsoport meghatározását. Néhány, nem L. pneumophila 1-es szerocsoportba tartozó fertőzésben szenvedő betegnél szerokonverzió következik be L. pneumophila 1-es szerocsoportba. Ezzel szemben a L. pneumophilától eltérő Legionella-fajokra szerokonverziót mutató betegek Legionella PCR-termékeinek szekvenciaalapú azonosítása azt jelzi, hogy néhányan valószínűleg L. pneumophilával fertőződtek (nem publikált megfigyelések). Alkalmanként keresztreaktív antitesteket találnak olyan betegeknél is, akik nem Legionella-baktériumok, köztük pseudomonádok, mycobacteriumok, Bacteroides fajok és Campylobacter fajok által okozott fertőzésekben szenvednek. Érdekes keresztreakció lép fel az L. bozemanii és a Rickettsia typhi között egy közös antigén következtében.

Nukleinsav-amplifikáció

A közelmúltban a DNS-kimutatási technikák ígéretesnek bizonyultak a Legionella-fertőzés gyors diagnózisára. A PCR lehetővé teszi a Legionella DNS parányi mennyiségének specifikus felerősítését, rövid időn belül eredményt ad, és alkalmas bármely Legionella faj és szerocsoport által okozott fertőzés kimutatására. Jelenleg a Legionella PCR csak korlátozott számú laboratóriumban áll rendelkezésre, amelyek különböző házon belüli próbákat használnak.

A PCR-t sikeresen alkalmazták a Legionella DNS kimutatására számos környezeti és klinikai mintában. Az alsó légutakból származó minták vizsgálatakor a PCR többször bizonyította, hogy érzékenysége megegyezik vagy nagyobb, mint a tenyésztésé . A PCR-t valóban a köpetet termelő betegek esetében a választás tesztjének lehet tekinteni. A PCR szerepe más mintatípusok vizsgálatában kevésbé egyértelmű. A legionella DNS 30-86%-os érzékenységgel kimutatható a legionárius betegségben szenvedő betegek vizelet-, szérum- és leukocitamintáiból . A PCR érzékenysége valószínűleg nő, ha a betegség korai szakaszában nyert mintákat vizsgálják, és ha minden betegből >1 mintatípust vizsgálnak . A toroktamponok is alkalmasak lehetnek PCR-vizsgálatra, de ezt az alkalmazást csak egyetlen tanulmányban értékelték.

További munkára van szükség egy olyan standard PCR-módszer kidolgozásához, amely elég megbízható ahhoz, hogy a kutatólaboratóriumon kívül is használható legyen. A nem légúti mintákon való alkalmazása különösen vonzó, mert így megkerülhető az olyan betegek problémája, akik nem adnak köpetmintát. Az optimális PCR-teszt kifejlesztését megnehezítette, hogy egyes kereskedelmi forgalomban kapható DNS extrakciós készletek időnként Legionella DNS-t tartalmaznak. Az ilyen készletek használata a minták feldolgozásához hamis pozitív eredményeket eredményezhet, és rávilágít annak fontosságára, hogy minden egyes vizsgálati menetben megfelelő kontrollok szerepeljenek.

Tesztelési stratégia

Mivel a legionárius betegség klinikailag vagy radiográfiailag nem különíthető el a tüdőgyulladás más okaitól, a Legionella-fertőzés vizsgálatára vonatkozó döntés nehéz lehet, és gyakran rendszertelenül hozzák meg. Fontos ismerni a helyi epidemiológiát. Néhány laboratórium azokon a területeken, ahol a Legionella fajok a tüdőgyulladás gyakori okozói, úgy döntött, hogy a tüdőgyulladásban szenvedő betegektől vett összes köpetmintát rutinszerűen Legionella táptalajon tenyésztik. Kevés laboratórium lenne azonban képes igazolni a rutinszerű Legionella tenyésztéssel járó többletköltséget. A legtöbb helyen a Legionella-fertőzés előfordulása ismeretlen, és a Legionella-fertőzés diagnosztikai vizsgálatának elrendeléséről szóló döntés általában a veszélyeztetett betegekre, a súlyos tüdőgyulladásban szenvedő betegekre és a járványkitörések esetére korlátozódik. Minden bizonnyal ki lehet választani a betegek azon részhalmazát, akiknél a Legionella diagnosztikai tesztek hozama valószínűleg viszonylag magas lesz. Ebbe a csoportba tartoznak az idősek, a dohányosok, az immunszupprimált egyének, a krónikus tüdőbetegségben szenvedők, a Legionellával kolonizált vízkészletű kórházakban lakó betegek és a cserepes keveréknek kitett egyének. A legionárius betegség előfordulása magasabb a súlyos tüdőgyulladásban szenvedő betegek körében, és minden tüdőgyulladásban szenvedő, intenzív osztályra felvett beteget meg kell vizsgálni e fertőzésre.

Ahol az L. pneumophila 1-es szerocsoportja a Legionella-fertőzés uralkodó oka, vagy az L. pneumophila 1-es szerocsoportjával való fertőzés kitörésekor a vizelet antigén teszt különösen értékes diagnosztikai eszköz. Egy olyan kereskedelmi vizeletantigén-teszt kifejlesztése, amely más humán Legionella-kórokozókat is megbízhatóan kimutatja, jelentős előrelépés lenne, és valószínűleg szinte minden környezetben ezt a diagnosztikai tesztet választanák. Azokon a földrajzi helyeken, ahol a L. pneumophila 1. szerocsoportjától eltérő legionellák számszerűen fontos kórokozók, a jelenlegi vizeletantigén-tesztek még mindig hasznosak, de nem használhatók egyedüli diagnosztikai eszközként. Ha rendelkezésre áll, a Legionella PCR a vizelet antigén vizsgálatával kombinálva valószínűleg a legjobb kezdeti vizsgálati stratégia, amely kimutatja az összes Legionella fajt, és olyan időkeretben szolgáltat eredményt, amely befolyásolja a klinikai kezelést.

Ahol a PCR nem áll rendelkezésre, ott a vizelet antigén vizsgálat az alsó légúti minták tenyésztésével kombinálva a legjobb vizsgálati kombináció. A tenyésztés továbbra is fontos diagnosztikai eszköz, de viszonylag alacsony érzékenysége és az alsó légúti minta rendelkezésre állásától való függősége miatt egyedüli diagnosztikai tesztként nem megfelelő. Bár a szerológiai vizsgálat nincs hatással a kezdeti kezelésre, hasznos lehet, ha a fertőzés akut fázisában nem állítható fel specifikus diagnózis, de mind az akut, mind a lábadozó fázisban lévő mintákat párhuzamosan kell vizsgálni. A legionárius betegség feltételezett kitörése során a diagnózis agresszív megközelítése indokolt, amely a vizsgálati módszerek kombinációjának alkalmazását foglalja magában.

A Legionella fajok alkalmanként Pontiac-lázat okozhatnak, egy akut, lázas, nem tüdőbetegséget, amelyet magas támadási arány, rövid lappangási idő és gyors gyógyulás jellemez. A Pontiac-láz diagnózisa általában a járványok kitörése során a jellegzetes klinikai jellemzők felismerésén alapul, és a diagnózist az érintett személyek szerológiai vizsgálatával erősítik meg. A tenyésztés alkalmazása nagyrészt a környezeti minták vizsgálatára korlátozódik a járvány forrásának meghatározására, bár a L. pneumophila 1. szerocsoportját izolálták egy Pontiac-lázban szenvedő gyermek légcsőaspirátumából.

Következtetések

A Légionella-fertőzés kétségtelenül alulismételt. A diagnózis speciális tesztek használatára támaszkodik, gyakran kombináltan. A vizeletantigén-tesztek, a köpettenyésztés és az alsó légúti minták PCR-vizsgálata a legfontosabb diagnosztikai eszközök a Legionella-fertőzés kimutatására a betegség korai szakaszában. A patogén legionellák szélesebb körét kimutató vizeletantigén-tesztek és a standardizált PCR-tesztek kifejlesztése jelentős előrelépés lesz a Legionella-diagnosztikában. A továbbfejlesztett diagnosztikai tesztek fokozott elérhetősége és használata segíteni fog a legionárius betegség epidemiológiájának jobb jellemzésében, beleértve a valódi előfordulást és a földrajzi eltéréseket.

Köszönet

Hálás vagyok Steve Chambersnek a kéziratban lévő cikkhez fűzött hasznos megjegyzéseiért.