Anyagok és módszerek
A Légierő Kutatási Laboratóriumának emberi alanyok védelmét szolgáló intézményi felülvizsgálati bizottságától kaptunk engedélyt, protokollszám: FWR20180101H. Az alanyokat egyénileg tájékoztattuk, és egy harmadik fél által tanúsított beleegyezési dokumentumokat írtak alá. Öt alanytól gyűjtöttünk mintát az Epicentre Catch-All™ mintagyűjtő tampon (Epicentre, Madison, WI) és az Isohelix GeneFiX™ nyál DNS-gyűjtő készlet (Isohelix, Kent, Egyesült Királyság) segítségével. Minden begyűjtött mintát ugyanazon a napon gyűjtöttünk, legalább 30 perc különbséggel az egyes gyűjtések között, vagy a résztvevők időzítési korlátai miatt 3 nap alatt. Alanyonként két tampont gyűjtöttünk; mindkét tampont 10-15 másodpercig dörzsöltük az arc belső oldalához. Hat köpetmintát gyűjtöttünk: a gyártó utasításai szerint közvetlenül vízivás, ebéd, szénsavas üdítőital, sportital vagy kávé fogyasztása után.
A tamponokat az Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre) segítségével extraháltuk. Az első tampont változatlan formában dolgoztuk fel, a másodikat pedig a Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) segítségével tisztítottuk meg a szövettenyésztési sejtlízátumokból származó genomi DNS tisztítására szolgáló mikrocentrifugálási protokollt alkalmazva. Nem volt sejtmosási lépés, mivel a minták már oldatban voltak. A köpetmintákat a QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) segítségével extraháltuk a gyártó módosított nyál extrakciós protokolljával.
A minták mennyiségi meghatározása a NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) és a Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) segítségével történt a Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit segítségével. A NanoDrop-ot a minták tisztaságának értékelésére is használtuk a 260 és 280 nm-en mért abszorbanciaértékek (A260/A280) összehasonlításával. Mindkettőt a gyártó protokollja szerint használtuk. A Qubit-koncentrációk alapján 10 ng/μL-re normalizált extrahált mintákat 2%-os E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific) segítségével elemeztük. A kivont DNS minőségének meghatározására az Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA), valamint a High Sensitivity DNA Chip-et használták.
A mintákat ezután az Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével elemezték a mogyoróallergiához kapcsolódó két genetikai marker vizsgálatára: rs7192 és rs9275596 . A genotipizálás gyors rámpás pre-polimeráz láncreakció (PCR) beállítással: 60 °C 1 percig, 95 °C-os tartási ciklus 10 percig, 40 ciklus 95 °C 15 s-ig, majd 60 °C 1 percig, és poszt-PCR 60 °C-on 1 percig. TaqPath ProAmp Master Mixet (Thermo Fisher Scientific) használtunk. Az egynukleotid-polimorfizmus (SNP) próbákat a gyártó által ajánlott koncentráció felében használtuk. A végső térfogat 10 µl volt.
Eredmények
A QuickExtract oldattal végzett tampon extrakciós módszer nagy mennyiségű DNS-t eredményezett. A tamponból minden további feldolgozás nélkül nyert DNS-értékek 1,38 és 54,2 pg/µL között mozogtak a Bioanalyzerrel meghatározva (Additional file 1: S1 táblázat). Laboratóriumunk korábbi, nem közölt eredményei azonban azt mutatták, hogy a szekvenálási kísérletek gátoltak, amikor a könyvtárakat közvetlenül a QuickExtract oldatos extrakciókból készítettük. Ezért ezeket a mintákat egy Wizard oszlopos tisztítási protokoll segítségével tisztítottuk, ami a várakozásoknak megfelelően csökkentette a koncentrációt (2,59 és 38,2 pg/µL között), és az A260/A280 arányokat az általánosan elfogadott tartományhoz (1,8-2,1) közelebb hozta.
A gyártó protokollja szerint gyűjtött és a QIAamp Blood DNA Kit segítségével extrahált köpetminták koncentrációja 1,01 ng/μL és 8,20 ng/μL között volt. Az A260/A280 mérés által jelzett tisztaság jellemzően a DNS-tartományban volt (lásd 1. kiegészítő fájl: S1 táblázat). Az alanyok különböző italok fogyasztása vagy ebéd után gyűjtött köpetminták egyike sem mutatott olyan DNS-koncentrációt és tisztasági értéket, amely jelentősen különbözött volna a gyártó protokollja (30 perces koplalás) alapján gyűjtött mintáktól (1. ábra).
A minták koncentrációja három különböző számszerűsítési módszerrel (Nanodrop, Qubit és Bioanalyzer) és a tisztaság értékelése a 260 és 280 nm-en mért abszorbancia arányával. A “CatchAll” körülmények a két tampongyűjtés és a “Genefix” a hat köpetgyűjtés. A bal oldali y-tengelyen a nyálminták koncentrációja, míg a jobb oldali y-tengelyen a köpetminták koncentrációja látható. Két tengelyt használtunk, mivel a másodlagos tisztítás nélküli tamponminta (CatchAll + QuickExtract) olyan szennyeződéseket tartalmaz, amelyek a Nanodropban 260 nm-en elnyelődnek. *p < 0,05, ***p < 0,001
A Qubit 4.0 leolvasások alapján 10 ng/μL-re normalizált extrahált mintákat 2%-os E-Gel-en futtattuk 1 kb létra használatával (Additional file 1: S1 ábra). Azt vártuk, hogy a gél teteje felé egy sávot látunk, amely a nagy molekulatömegű DNS-kivonatot képviseli. A várakozásoknak megfelelően a különböző nyálgyűjtési módszerekből kivont DNS nagy molekulatömegű volt. Annak ellenére, hogy 10 ng/µl bemenetre normalizáltuk, a legtöbb nyálminta nem eredményezett egyértelmű sávot, ami vagy töltésinterferensek jelenlétére, vagy valamilyen más szisztematikus problémára utal.
A Bioanalizátoron végzett részletesebb méret- és tisztaságelemzés azt mutatta, hogy minden minta és minden körülmények között túlnyomórészt nagy molekulatömegű DNS-t tartalmazott, és hasonló koncentrációban (2. ábra). A fent említett, a tamponkivonat tisztítását követő alacsony koncentráción kívül a DNS minőségében, méretében vagy koncentrációjában nincs a gyűjtési körülményekkel (evés vagy ivás) összefüggő tendencia, amely az elektroszkópos jelek elemzésekor nyilvánvalóvá válna. Úgy tűnik azonban, hogy van egy alanyfüggő változás, bár ezt a jelenséget nem követtük tovább.
A köpetminták bioanalizátoros elektropherogramjának nyomai. Minden alany külön-külön látható, a színek a gyűjtési körülményeket jelölik: a gyártó utasításait követve (piros), víz fogyasztása után (kék), ebéd elfogyasztása után (zöld), szénsavas ital fogyasztása után (cián), sportital fogyasztása után (magenta) és kávé fogyasztása után (narancs)
Végül SNP genotipizálással teszteltük a kinyert DNS alkalmasságát a downstream molekuláris folyamatokra (3. ábra). Az összes alany összes extrahált mintája sikeresen tudott használható eredményeket produkálni a mogyoróallergiával összefüggésbe hozható két SNP genotipizálására , kivéve az egyik tisztított tamponmintát (5B alany).
Allelikus diszkriminációs plotok az rs7192 és rs9275596 esetében. Az “X” jelzi azt a mintát, amely nem amplifikálódott (5B alany). A piros/alsó minták homozigóták az 1. allélra (X-tengely), a zöld/középső minták heterozigóták, a kék/bal oldali minták pedig homozigóták a 2. allélra (Y-tengely)
Diszkusszió
A genetikai kutatási tanulmány, kereskedelmi termék vagy egészségügyi beavatkozás tervezésekor a használhatóság és a végfelhasználói megfelelés két kritikus szempont. A bőrszúrást igénylő vérvételi eszközöknél a fájdalomtól való idegenkedés miatt alacsonyabb lehet a megfelelőség. A laboratóriumunkban végzett megfigyelések alapján anekdotikusan megfigyeltük, hogy csökkent a beiratkozási arány a tanulmányokba, ha az elsődleges különbség a vénapunkció a nyálmintavétellel szemben. Nem végeztünk ellenőrzött vizsgálatot ennek a jelenségnek a kivizsgálására; inkább a nyálmintavétel mellett döntöttünk a könnyű használat, a nyilvánvalóan megnövekedett beiratkozási arány és a laboratóriumunkban túlnyomórészt végzett kutatások típusa alapján. Mivel a vizsgálataink a nyálmintavétel önadagolásával járnak, arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogy a különböző valószínűsíthető terepi gyűjtési körülményeket, elsősorban a különböző étel- és italfogyasztást követően elegendő mennyiségű és minőségű DNS van-e jelen a későbbi molekuláris alkalmazásokban való felhasználáshoz. A vizsgálati terv nem az egyének közötti kereszt-összehasonlításra irányult; inkább a mintagyűjtés alanyon belüli változékonyságának összehasonlítására törekedtünk. Ezt a célt szem előtt tartva nem figyeltünk meg jelentős csökkenést a DNS mennyiségében, amit a gyártó utasításaitól való eltérés okozott, miszerint a gyűjtést megelőzően 30 percig koplalni kell.
Noha a DNS mennyisége fontos, a fejlett molekuláris biológiai technikák szempontjából sokkal kritikusabb a nyert DNS minősége. Vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a nyálminták evés és ivás utáni gyűjtése nem befolyásolta a nagy molekulasúlyú DNS hozamát. Az ilyen DNS kritikus fontosságú az újgenerációs szekvenáláshoz, a tömbszkenneléshez és a PCR genotipizáláshoz. Továbbá egy kísérleti teszt, amely két független genetikai célpontot használt a PCR-genotipizálásban, kimutatta, hogy ezek a minták alkalmasak a molekuláris elemzésekre.
Ezzel a vizsgálattal az volt a célunk, hogy megnézzük, befolyásolja-e a nyál DNS-gyűjtő készlettel gyűjtött nyálból származó DNS minőségét és mennyiségét, ha nem követjük a gyártó utasításait, azaz ha közvetlenül a gyűjtés előtt iszunk vagy eszünk. Hipotézisünkkel összhangban nem tapasztaltunk különbséget az izolált DNS mennyiségében vagy minőségében.
Következtetés
A genetikai vizsgálatok túlnőttek a tisztán tudományos törekvések körén, és ma már a fogyasztók körében is elterjedtek. Az emberi minták optimalizálása érdekében e vizsgálatokhoz a gyártók egyszerű, robusztus gyűjtési módszerek kifejlesztésére törekszenek. A nyálmintavétel e módszerek közül a legkevésbé invazív, kiváló minőségű DNS-t eredményez, és kiváló termékstabilitást biztosít. A különböző italok és/vagy rágcsálnivalók fogyasztását követően nyálból nyert DNS vizsgálatunk azt mutatta, hogy nincs jelentős különbség az Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix) segítségével gyűjtött DNS mennyiségében és minőségében, ha a minták gyűjtése nem a gyártó protokollja szerint történik. Bár ebben a vizsgálatban a minta mérete kicsi, a laboratóriumunkban végzett más vizsgálatokból származó megfigyelések összhangban vannak az itt bemutatott szisztematikus összehasonlításunk eredményeivel. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a nyálgyűjtés megbízható, nem invazív módszer a minták gyűjtésére mind a laboratóriumban, mind a terepen, és az ételtől és italtól való 30 perces tartózkodás követelménye ideális és nem abszolút érték.