How do design dos meus próprios primários?

Um dos factores mais importantes para o sucesso do sequenciamento automático de ADN é o design adequado dos primários. Este documento descreve os passos envolvidos neste processo e as principais armadilhas a evitar.

Os primers de sequenciamento devem ser capazes de recozer o DNA alvo em um local previsível e em um fio previsível. Além disso, eles devem ser capazes de extensão por Taq DNA Polimerase.

Algumas pessoas estão confusas sobre como examinar uma sequência de DNA para escolher uma sequência de primer apropriada. Aqui estão algumas coisas para os novatos se lembrarem:

• As sequências são sempre escritas de 5′ a 3′. Isto inclui a sequência do seu ADN modelo (se conhecido), a sequência do ADN vectorial em que está inserido, e a sequência de primários propostos. Nunca escreva uma sequência de primers invertida ou apenas se confundirá a si e aos outros.
• A polimerase estende sempre a extremidade 3′ do primer, e a sequência que irá ler será a mesma vertente (sentido ou anti-senso) que o próprio primer.
• Assim, se você escolher uma seqüência de primer que você pode ler na sua seqüência de origem (por exemplo, no vetor), a seqüência que você obterá se estenderá da direita do primer (3′) end.
• Conversamente, se você escolher um primer da cadeia oposta ao que sua seqüência ‘de origem’ lê, a seqüência resultante será lida para a esquerda.

Aqui estão alguns exemplos:

Suponha que você tenha um vetor com a seguinte seqüência em torno do Local de Clonagem Múltipla (o ‘MCS’):

 TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI

Se você clonou seu DNA de interesse entre os sites BamHI e EcoRI, você poderia seqüenciar usando o primer ‘CTTGATGCTAGTACTACATC’ (lembre-se – isso está escrito 5′ para 3′) e você obterá a seguinte seqüência do Core:

 TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)

E se você quisesse a seqüência do outro fio – Eco para Bam – em vez disso? Nesse caso, você precisa selecionar alguma seqüência à direita e depois complementá-la antes de solicitar o oligo. Escolhendo alguma sequência da figura acima:

 CTGATGCTCATATGTTAATA

Esta NÃO é a sequência primer – ela é copiada literalmente da sequência acima. Na verdade, se você usasse esta sequência para um primer, a sequência prosseguiria para a direita, longe da sua inserção. Em vez disso, complete a sequência inversa:

 TATTAACATATGAGCATCAG

NOW isto deve produzir a sequência da vertente oposta:

 CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)

Algumas letras miúdas: Só raramente a sequência mostra os nucleótidos imediatamente a jusante do primer. Eu tomei alguma licença didática nos exemplos acima.

Mais Conceitos Avançados: Como desenhar um Primer que funcione.

Geralmente, você está começando com alguma pequena quantidade de sequência conhecida que você deseja estender. Veja como proceder:

I. Desenhe primers apenas a partir de dados de sequência precisos. A sequência automatizada (e na verdade qualquer sequência) tem uma probabilidade finita de produzir erros. A seqüência obtida muito distante do primer deve ser considerada questionável. Para determinar o que está ‘muito longe’, sugerimos fortemente que nossos clientes leiam o memo Interpretação de Cromatogramas Sequenciais, que descreve como avaliar a validade dos dados obtidos a partir dos seqüenciadores ABI. Selecione uma região para a colocação do primer onde a possibilidade de erro de sequência é baixa. II. Restrinja sua busca às regiões que melhor reflitam seus objetivos.

Você pode estar interessado em maximizar os dados da seqüência obtida, ou pode precisar apenas examinar a seqüência em um local muito específico no modelo. Tais necessidades ditam colocações de primers muito diferentes.

1. Maximize a sequência obtida minimizando o potencial de erros:
   Generalmente, você deve projetar o primer até o 3′, desde que você tenha confiança na precisão da sequência da qual o primer é extraído. Primers em filamentos opostos devem ser colocados de forma escalonada tanto quanto possível.
2. Sequência alvo de uma região específica:
   Posicionar o primer para que a sequência desejada caia na região mais precisa do cromatograma. Os dados da sequência são muitas vezes mais precisos cerca de 80-150 nucleotídeos longe do primer. Não conte com a boa sequência a menos de 50 nucleotídeos de distância do iniciador ou a mais de 300 nt de distância (embora muitas vezes tenhamos a sequência começando imediatamente após o iniciador, e frequentemente retornamos 700 nt de sequência precisa).

III. Localize os iniciadores candidatos:

Identificar potenciais iniciadores sequenciais que produzem um emparelhamento estável da base com o ADN do modelo sob condições apropriadas para o ciclo sequencial. É fortemente sugerido que você use um computador nesta etapa. Características do primer sugerido:

1. O comprimento deve estar entre 18 e 30 nt, sendo o ideal 20-25 nt. (Embora tenhamos tido alguns sucessos com primers mais longos que 30 e mais curtos que 18).
2. O conteúdo do G-C de 40-60% é desejável.
3. O Tm deve estar entre 55 C e 75 C. Atenção: a antiga regra “4 graus para cada G-C, 2 graus para cada A-T” funciona mal, especialmente para oligo-elementos mais curtos que 20 ou mais longos que 25 nt. Em vez disso, tente:

    Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)

   Existe uma calculadora Tm baseada na web que você pode tentar em http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.

IV. Descarte primários candidatos que mostram uma auto-hibridização indesejável.

Primers que podem auto-hibridizar não estarão disponíveis para hibridização do template. Geralmente evite primers que possam formar 4 ou mais ligações consecutivas consigo mesmo, ou 8 ou mais ligações no total. Exemplo de um primer marginalmente problemático:

 5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'

Este oligo forma um dímero substancialmente estável consigo mesmo, com quatro ligações consecutivas em dois lugares e um total de oito ligações inter-fitas.

Primers com 3′ termina a hibridação mesmo transientemente se estenderá devido à ação da polimerase, arruinando assim o primer e gerando bandas falsas. Seja um pouco mais rigoroso ao evitar os dímeros 3′. Por exemplo, o seguinte primer auto-dimeriza-se com uma hibridação perfeita de 3′ em si mesmo:

 5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

O oligo acima é bastante ruim, e quase que certamente causará problemas. Note que a polimerase irá estender a extremidade 3′ durante a reacção de sequenciação, dando uma sequência muito forte ACTATGC. Estas bandas aparecerão no início dos seus dados ‘reais’ como picos imensos, ocluindo a sequência correcta. A maioria dos programas de desenho de primers irá detectar corretamente tais primers auto-dimerizáveis e irá avisá-lo para evitá-los.

Notem, no entanto, que nenhum programa de computador ou avaliação de regra de ouro pode prever com precisão o sucesso ou o fracasso de um primer. Uma cartilha que parece marginal pode ter um bom desempenho, enquanto outra que parece ser impecável pode não funcionar de todo. Evite problemas óbvios, desenhe os melhores primários que puder, mas se tiver poucas opções, tente apenas alguns primários candidatos, independentemente de potenciais falhas.

V. Verifique a especificidade do local do primário. Faça uma pesquisa de homologia de sequência (por exemplo, comparação de homologia de pontos) através de toda a sequência de modelos conhecidos para verificar se existem locais alternativos de iniciação. Descarte quaisquer primers que apresentem uma tendência ‘significativa’ para se ligarem a tais sites. Podemos fornecer apenas diretrizes aproximadas sobre o que é ‘significativo’. Evite primers onde locais alternativos estão presentes com (1) mais de 90% de homologia ao local primário ou (2) mais de 7 nucleotídeos homólogos consecutivos no final do 3′ ou (3) abundância maior que 5 vezes maior do que o local de priming pretendido. VI. Escolha entre os primers candidatos.

Se neste ponto você tiver vários primários candidatos, você pode selecionar um ou alguns que são mais ricos em A-T no final do 3′. Estes tendem a ser um pouco mais específicos em ação, de acordo com alguns investigadores. Você pode querer usar mais de uma cartilha, maximizando a probabilidade de sucesso.

Se você não tem candidatos que sobreviveram aos critérios acima, então você pode ser forçado a relaxar o rigor dos requisitos de seleção. Em última análise, o teste de um bom primer está apenas no seu uso, e não pode ser previsto com precisão por estas regras simplistas.

Com sorte, no entanto, você tem muitas opções de primers. Para um projeto de montagem de seqüência, projete mais primers do que você acha que realmente precisa para que se a seqüência não for tão longa quanto você esperava, você ainda possa obter dados sobrepostos suficientes para garantir um bom consenso de seqüência. Recomendamos que você sequencie ambas as sequências, para melhor confirmação. Em um dos fios, espalhe os primers de 500 a 700 nt (espaçamento mais curto é mais seguro!). No fio oposto, coloque os primers de forma escalonada longe dos primers do primeiro fio, como mostrado abaixo: