Wie entwerfe ich meine eigenen Primer?

Einer der wichtigsten Faktoren für eine erfolgreiche automatisierte DNA-Sequenzierung ist das richtige Primerdesign. Dieses Dokument beschreibt die Schritte, die in diesem Prozess involviert sind, und die wichtigsten Fallstricke, die es zu vermeiden gilt.

Sequenzierungsprimer müssen in der Lage sein, sich an die Ziel-DNA an einer vorhersehbaren Stelle und an einem vorhersehbaren Strang anzulagern. Außerdem müssen sie von der Taq-DNA-Polymerase verlängert werden können.

Einige Leute sind verwirrt darüber, wie man eine DNA-Sequenz untersucht, um eine geeignete Primer-Sequenz auszuwählen. Hier sind ein paar Dinge, die sich Neulinge merken sollten:

• Sequenzen werden immer von 5′ bis 3′ geschrieben. Dazu gehören die Sequenz Ihrer Template-DNA (falls bekannt), die Sequenz der Vektor-DNA, in die sie eingefügt wird, und die Sequenz der vorgeschlagenen Primer. Schreiben Sie eine Primer-Sequenz niemals umgekehrt, sonst verwirren Sie sich und andere nur.
• Die Polymerase verlängert immer das 3′-Ende des Primers, und die Sequenz, die Sie lesen werden, ist der gleiche Strang (sense oder anti-sense) wie der Primer selbst.
• Wenn Sie also eine Primer-Sequenz wählen, die Sie in Ihrer Ausgangssequenz (z.B. im Vektor) lesen können, wird die Sequenz, die Sie erhalten, vom rechten (3′) Ende des Primers ausgehen.
• Umgekehrt, wenn Sie einen Primer von dem Strang wählen, der dem Ihrer „Ausgangs“-Sequenz entgegengesetzt ist, wird die resultierende Sequenz nach links gelesen.

Hier sind ein paar Beispiele:

Angenommen, Sie haben einen Vektor mit der folgenden Sequenz um die Multiple Cloning Site (die ‚MCS‘):

 TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI

Wenn Sie Ihre gewünschte DNA zwischen den BamHI- und EcoRI-Stellen kloniert haben, können Sie die Sequenz mit dem Primer „CTTGATGCTAGTACTACATC“ sequenzieren (denken Sie daran, dass 5′ zu 3′ geschrieben wird) und Sie erhalten die folgende Sequenz aus dem Core:

 TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)

Was ist, wenn Sie stattdessen eine Sequenz vom anderen Strang – Eco zu Bam – benötigen? In diesem Fall müssen Sie eine Sequenz auf der rechten Seite auswählen und sie dann rückwärts komplementieren, bevor Sie das Oligo anfordern. Wählen Sie eine Sequenz aus der obigen Abbildung aus:

 CTGATGCTCATATGTTAATA

Dies ist NICHT die Primer-Sequenz – sie ist wortwörtlich aus der obigen Sequenz kopiert. Wenn Sie diese Sequenz als Primer verwenden würden, würde die Sequenzierung nach rechts, weg von Ihrem Insert, verlaufen. Führen Sie stattdessen eine Umkehrkomplementierung dieser Sequenz durch:

 TATTAACATATGAGCATCAG

Nun sollte dies die Sequenz des Gegenstrangs ergeben:

 CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)

Ein wenig Kleingedrucktes: Nur selten zeigt die Sequenzierung tatsächlich die Nukleotide unmittelbar hinter dem Primer. In den obigen Beispielen habe ich mir einige didaktische Freiheiten genommen.

Weitere Konzepte: Wie man einen funktionierenden Primer entwirft.

In der Regel beginnt man mit einer kleinen Menge bekannter Sequenzen, die man verlängern möchte. So gehen Sie vor:

I. Entwerfen Sie Primer nur anhand genauer Sequenzdaten. Bei der automatischen Sequenzierung (und eigentlich bei jeder Sequenzierung) gibt es eine endliche Fehlerwahrscheinlichkeit. Eine Sequenz, die zu weit vom Primer entfernt ist, muss als fragwürdig angesehen werden. Um festzustellen, was „zu weit“ ist, empfehlen wir unseren Kunden dringend die Lektüre des Memos Interpretation of Sequencing Chromatograms, in dem beschrieben wird, wie die Validität der mit ABI-Sequenzierern gewonnenen Daten zu bewerten ist. Wählen Sie eine Region für die Primerplatzierung, in der die Möglichkeit eines Sequenzfehlers gering ist. II. Beschränken Sie Ihre Suche auf Regionen, die Ihre Ziele am besten widerspiegeln.

Es kann sein, dass Sie an einer Maximierung der erhaltenen Sequenzdaten interessiert sind, oder dass Sie nur die Sequenz an einer ganz bestimmten Stelle in der Vorlage untersuchen müssen. Solche Bedürfnisse diktieren sehr unterschiedliche Primerplatzierungen.

1. Maximieren Sie die erhaltene Sequenz bei gleichzeitiger Minimierung des Fehlerpotenzials:
   Im Allgemeinen sollten Sie den Primer so weit zum 3′ entwerfen, wie Sie es schaffen können, solange Sie Vertrauen in die Genauigkeit der Sequenz haben, von der der Primer abgeleitet ist. Primer auf gegenüberliegenden Strängen sollten so weit wie möglich versetzt platziert werden.
2. Gezielte Sequenzierung einer bestimmten Region:
   Positionieren Sie den Primer so, dass die gewünschte Sequenz in den genauesten Bereich des Chromatogramms fällt. Die Sequenzdaten sind oft am genauesten in einem Abstand von 80-150 Nukleotiden vom Primer. Verlassen Sie sich nicht darauf, dass Sie eine gute Sequenz in einem Abstand von weniger als 50 Nukleotiden vom Primer oder in einem Abstand von mehr als 300 nt erhalten (obwohl wir oft Sequenzen erhalten, die unmittelbar nach dem Primer beginnen, und wir erhalten oft 700 nt genauer Sequenz).

III. Lokalisieren Sie mögliche Primer:

Identifizieren Sie potenzielle Sequenzierprimer, die unter für die Zyklussequenzierung geeigneten Bedingungen eine stabile Basenpaarung mit der Template-DNA erzeugen. Es wird dringend empfohlen, für diesen Schritt einen Computer zu verwenden. Vorgeschlagene Primer-Eigenschaften:

1. Die Länge sollte zwischen 18 und 30 nt liegen, wobei 20-25 nt optimal sind (obwohl wir einige Erfolge mit Primern hatten, die länger als 30 und kürzer als 18 waren).
2. Ein G-C-Gehalt von 40-60% ist wünschenswert.
3. Die Tm sollte zwischen 55 C und 75 C liegen. Achtung: Die alte Regel „4 Grad für jedes G-C, 2 Grad für jedes A-T“ funktioniert schlecht, besonders bei Oligos, die kürzer als 20 oder länger als 25 nt sind. Versuchen Sie stattdessen:

    Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)

   Es gibt einen webbasierten Tm-Rechner, den Sie unter http://www.rnature.com/oligonucleotide.html ausprobieren können.

IV. Verwerfen Sie Primerkandidaten, die eine unerwünschte Selbsthybridisierung aufweisen.

Primer, die sich selbst hybridisieren können, stehen für die Hybridisierung mit der Vorlage nicht zur Verfügung. Generell sollten Primer vermieden werden, die 4 oder mehr aufeinanderfolgende Bindungen mit sich selbst oder insgesamt 8 oder mehr Bindungen bilden können. Beispiel für einen geringfügig problematischen Primer:

 5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'

Dieses Oligo bildet mit sich selbst ein im Wesentlichen stabiles Dimer mit vier aufeinanderfolgenden Bindungen an zwei Stellen und insgesamt acht Bindungen zwischen den Strängen.

Primer mit 3′-Enden, die auch nur vorübergehend hybridisieren, werden durch die Wirkung der Polymerase verlängert, wodurch der Primer zerstört wird und falsche Banden erzeugt werden. Seien Sie etwas strenger bei der Vermeidung von 3′-Dimeren. Der folgende Primer beispielsweise dimert sich selbst mit einer perfekten 3′-Hybridisierung auf sich selbst:

 5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

Das obige Oligo ist ziemlich schlecht und verursacht fast garantiert Probleme. Beachten Sie, dass die Polymerase das 3′-Ende während der Sequenzierungsreaktion verlängert, was zu einer sehr starken Sequenz ACTATGC führt. Diese Banden werden am Anfang Ihrer „echten“ Daten als riesige Peaks erscheinen und die korrekte Sequenz verdecken. Die meisten Primer-Design-Programme erkennen solche selbstdimerisierenden Primer korrekt und warnen Sie, sie zu vermeiden.

Beachten Sie jedoch, dass kein Computerprogramm oder eine Faustregel den Erfolg oder Misserfolg eines Primers genau vorhersagen kann. Ein Primer, der unbedeutend zu sein scheint, kann gut funktionieren, während ein anderer, der einwandfrei zu sein scheint, möglicherweise überhaupt nicht funktioniert. Vermeiden Sie offensichtliche Probleme, entwerfen Sie die besten Primer, die Sie können, aber wenn Sie nur wenige Optionen haben, probieren Sie einfach ein paar Primer-Kandidaten aus, ungeachtet möglicher Fehler.

V. Überprüfen Sie die Ortsspezifität des Primers. Führen Sie eine Sequenzhomologiesuche (z. B. einen Dot-Plot-Homologievergleich) durch alle bekannten Vorlagensequenzen durch, um nach alternativen Primerstellen zu suchen. Verwerfen Sie alle Primer, die eine „signifikante“ Tendenz zur Bindung an solche Stellen aufweisen. Wir können nur grobe Richtlinien dafür geben, was „signifikant“ ist. Vermeiden Sie Primer, bei denen alternative Stellen vorhanden sind, die (1) zu mehr als 90 % mit der primären Stelle homolog sind oder (2) mehr als 7 aufeinanderfolgende homologe Nukleotide am 3′-Ende aufweisen oder (3) in einer Häufigkeit vorkommen, die mehr als 5-mal höher ist als die der vorgesehenen Priming-Stelle. VI. Auswahl unter den Primer-Kandidaten.

Wenn Sie zu diesem Zeitpunkt mehrere Primer-Kandidaten haben, können Sie einen oder einige auswählen, die am 3′-Ende mehr A-T enthalten. Einigen Forschern zufolge sind diese etwas spezifischer in ihrer Wirkung. Möglicherweise möchten Sie mehr als einen Primer verwenden, um die Erfolgswahrscheinlichkeit zu maximieren.

Wenn Sie keine Kandidaten haben, die die oben genannten Kriterien erfüllen, sind Sie möglicherweise gezwungen, die strengen Anforderungen an die Auswahl zu lockern. Letztendlich zeigt sich ein guter Primer erst in der Anwendung und kann nicht durch diese vereinfachenden Faustregeln genau vorhergesagt werden.

Mit etwas Glück haben Sie jedoch viele Möglichkeiten für Primer. Für ein Sequenzassemblierungsprojekt sollten Sie mehr Primer entwerfen, als Sie wirklich benötigen, damit Sie, wenn die Sequenz nicht so lang ist wie erhofft, immer noch genügend überlappende Daten erhalten, um einen guten Sequenzkonsens zu erzielen. Wir empfehlen Ihnen, beide Stränge zu sequenzieren, um eine bessere Bestätigung zu erhalten. Auf einem Strang platzieren Sie die Primer im Abstand von 500 bis 700 nt (kürzere Abstände sind sicherer!). Auf dem gegenüberliegenden Strang platzieren Sie die Primer versetzt von den Primern des ersten Strangs, wie unten dargestellt: