The Berg Lab

Denne vejledning er tilpasset fra University of Arizona Department of Biochemistry and Molecular Biophysics General Biology Program for Science Teachers: Drosophila melanogaster and Mendelian Genetics, af Pete Geiger.

En introduktion til Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster er en lille, almindelig flue, der findes i nærheden af umodne og rådne frugter. Den har været brugt i over et århundrede til at studere genetik og adfærd. Thomas Hunt Morgan var den fremtrædende biolog, der studerede Drosophila tidligt i 1900-tallet. Han var den første til at opdage kønsbindinger og genetisk rekombination, hvilket placerede den lille flue i spidsen for den genetiske forskning. På grund af dens lille størrelse, nemme dyrkning og korte generationstid har genetikere brugt Drosophila lige siden.

Frugtfluer kan let skaffes fra naturen, og mange biologiske videnskabsvirksomheder bærer en række forskellige mutationer. Desuden sælger disse virksomheder alt udstyr, der er nødvendigt for at dyrke fluerne. Omkostningerne er relativt lave, og det meste udstyr kan bruges år efter år. Der findes en række laboratorieøvelser, som man kan købe, selv om nødvendigheden heraf er tvivlsom.

Hvorfor bruge Drosophila?

Lærere bør bruge frugtfluer til genetiske undersøgelser i gymnasiet af flere grunde:
1. De er små og let håndterbare.
2. De kan let bedøves og manipuleres individuelt med ukompliceret udstyr.
3. De er kønsdimorfe (hanner og hunner er forskellige), hvilket gør det ret let at skelne kønnene.
4. Jomfrufluer adskiller sig fysisk fra voksne voksne fluer, hvilket gør det let at skaffe jomfruhanner og -hunner til genetiske krydsninger.
5. Fluerne har en kort generationstid (10-12 dage) og klarer sig godt ved stuetemperatur.
6. Pleje og dyrkning af frugtfluer kræver kun lidt udstyr, er billigt og bruger kun lidt plads, selv ved store kulturer.

Gennem at bruge Drosophila vil eleverne:
1. Forstå mendelsk genetik og nedarvning af egenskaber
2. Trække konklusioner om arvelighedsmønstre ud fra de opnåede data
3. Konstruere fælder til at fange vilde populationer af D. melanogaster
4. Få en forståelse af D. melanogaster, et insekt, der udviser fuldstændig metamorfose, i sin livscyklus
5. Konstruere krydsninger af fangede og kendte vildtyper og muterede fluer
6. Lære teknikker til at manipulere fluer, kønsbestemme dem og føre præcise journalnotater
7. Lære dyrkningsteknikker til at holde fluerne sunde
8. Indse, at mange videnskabelige eksperimenter ikke kan udføres og afsluttes inden for en eller to laboratoriesessioner

Nationale standarder, der dækkes i disse lektioner:
Indhold:
1. Organismer har brug for et sæt instruktioner til at specificere egenskaber (arvelighed)
2. Arvelig information er placeret i generne.
3. Kombinationer af egenskaber kan beskrive en organismes karakteristika.

Eelevernes mål:
1. Identificere spørgsmål og begreber, der styrer videnskabelige undersøgelser
2. Udforme og gennemføre videnskabelige undersøgelser
3. Formulere og revidere videnskabelige forklaringer og modeller ved hjælp af logik og beviser
4. Formulere og forsvare et videnskabeligt argument

Drosophilas genetik er veldokumenteret, og flere offentlige websteder indeholder det komplette annoterede genom. Derfor har de lærere eller elever, der ønsker at se, hvor deres mutationer forekommer, en klar reference til rådighed.

Da Drosophila har været så udbredt inden for genetik, er der mange forskellige typer mutationer, der kan købes. Desuden kan den opmærksomme studerende finde mutationer i sine egne vildtfangede kulturer, da mutationer på grund af den korte generationstid er relativt almindelige sammenlignet med andre dyrearter.
Klassifikation
Domæne: Eukarya
Kongedømme: Animalia
Familie: Arthropoda
Klasse: Insecta
Ordning: Insecta
Ordning: Insekt: Diptera
Familie: Insekts:: Diptera
Familie: Insekts:: Drosophilidae
Genus: Drosophilidae
Genus: Drosophilidae
Genus: Drosophilidae Drosophila (“dug elsker”)
Species: melanogaster (“mørk tarm”)
Livscyklus hos Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster udviser fuldstændig metamorfisme, hvilket betyder, at livscyklusen omfatter et æg, larveform (ormelignende form), puppe og endelig fremkomst (eclosure) som en flyvende voksen. Dette er det samme som den velkendte metamorfose hos sommerfugle. Larvestadiet har tre stadier eller skiftninger.

Dag 0: Hunnen lægger æg
Dag 1: Æggene klækkes
Dag 2: Første stadie (en dags længde)
Dag 3: Andet stadie (en dags længde)
Dag 5: Tredje og sidste stadie (to dages længde)
Dag 7: Larven begynder sit vandringsstadie. Pupariation (puppedannelse) finder sted 120 timer efter æglægningen
Dag 11-12: Eclosion (voksne kommer ud af puppehuset).

Hunnerne bliver kønsmodne 8-10 timer efter eclosion

– Drosophila melanogaster’s generationstid varierer med temperaturen. Ovenstående cyklus er for en temperatur på ca. 22°C (72°F). Fluer, der opdrættes ved lavere temperatur (til 18°C eller 64°F), vil tage ca. dobbelt så lang tid at udvikle sig.
– Hunner kan lægge op til 100 æg/dag.
– Jomfruhunner kan lægge æg; de vil dog være sterile og få i antal.

Når æggene klækkes, bør små larver være synlige i vækstmediet. Hvis dit medie er hvidt, skal du kigge efter det lille sorte område (mundkrogene) ved larvernes hoved. Nogle tørrede forblandede medier er blå for at hjælpe med at identificere larverne, men det er ikke en nødvendighed, og med lidt tålmodighed og øvelse kan larverne let ses. Når larverne æder, ødelægger de desuden den glatte overflade af mediet, og ved kun at se på overfladen kan man derfor se, om der er larver til stede. Det er dog altid en god idé at dobbelttjekke ved hjælp af et stereomikroskop. Efter tredje instar vil larverne begynde at vandre op i kulturglasset for at forpuppe sig.

Pleje, vedligeholdelse og manipulation af Drosophila

Indledning
For at inkorporere frugtfluer i klasseværelset vil det være nødvendigt at vedligeholde kulturer af fluer til manipulation i krydsninger og som backup for eventuelle uheld, der måtte opstå. Det er meget let at dyrke dem, og det anbefales at lade eleverne vedligeholde deres egne fluekulturer. På den måde vil hver enkelt elev eller gruppe være direkte ansvarlig for pasning og langtidsvedligeholdelse af fluerne, herunder fremstilling af store kulturpopulationer til deres krydsninger. Når eleverne er direkte involveret, opnår de færdigheder og en større forståelse af fluernes krav og adfærd. Læreren bør forblive træner, ikke foredragsholder, og hjælpe eleverne med teknikkerne. Underviseren skal vedligeholde lagerkulturer af alle stammer og mutanter, der anvendes af eleverne, i tilfælde af at den ovennævnte uforudsigelige hændelse indtræffer, og elevkulturer dør ud eller bliver blandet sammen. Tab af kulturer er undtagelsen snarere end reglen, og så længe eleverne genkultiverer deres fluer regelmæssigt, og der ikke sker en masseforurening, kan fluerne holdes i årtier.
Flasker og hætteglas
Thomas Hunt Morgan brugte glasmælkeflasker til sine eksperimenter, og faktisk kan enhver beholder bruges, herunder babyglas og diverse beholdere. For at gøre det let at dyrke og overføre kulturer er ensartede flasker og hætteglas imidlertid den bedste fremgangsmåde. Begge kan købes i en forretning for biologisk udstyr. Flasker bruges hovedsagelig til at vedligeholde store populationer af fluer, mens kulturflasker er nyttige til at vedligeholde mindre populationer og er den foretrukne beholder til at konstruere studenterkrydsninger. Hvis man ønsker at opretholde stamkulturer i en længere periode eller at genbruge flasker og hætteglas, er det vigtigt at rengøre og sterilisere dem fuldstændigt. Dette er for at forhindre udbrud af skadedyr og sygdomme.

For at rengøre flasker og hætteglas skal de først fryses ned for at dræbe eventuelle fluer i dem. Fjern fødevarerne, vask dem godt, og steriliser dem derefter ved autoklavering (i 20 minutter ved 121 °C og 15 psi; hvis beholderne er af plast, skal du sikre dig, at de kan autoklaveres) eller vask dem i en 10 % klorblødningsopløsning.

Flasker og hætteglas kan købes i forskellige størrelser og materialer. Glas er effektivt, men hvis det tabes, kan en studerende miste 2 ugers data ved et enkelt spild. Autoklaverede (sterile) plastflasker kan fås og er at foretrække til brug for studerende. Størrelsen af glassene varierer fra 96 mm x 25 mm til større størrelser, men den mindre størrelse anbefales til fremstilling af krydsninger og vedligeholdelse af små kulturer. Der findes en række forskellige propper, lige fra blødt bomuld til skumpropper. Dette er et spørgsmål om præferencer og omkostninger, men bomuld fungerer fint og kan købes på et lokalt apotek i en snæver rækkevidde.
Hvor man kan købe forsyninger:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, A division of Genesee Scientific
Sådan ser de ud:

StereomikroskopDrosophila-flaskeDrosophila-flasker

Flyfoder
Det første skridt i forberedelsen af kulturflasker er at tilsætte fødemedier. Der findes en række forskellige typer føde til fluerne; nogle kræver tilberedning, og andre købes allerede tilberedte og dehydrerede. Sidstnævnte kan købes hos et biologisk forsyningsfirma. Dette er naturligvis meget hurtigere og nemmere end at tilberede kogte medier, så meget, at eleverne selv kan fylde deres egne hætteglas med medier. Det skal dog være fuldstændig rehydreret for at opnå de bedste resultater, da dette er den eneste vandkilde for voksne dyr og larver. Følg derfor nedenstående forslag for at sikre et fuldstændigt hydreret medie:

Dehydreret medie
Tilsæt tørt medie til flasken eller hætteglasset til ca. 1/5 til 2/5 volumen. Tilsæt vand, indtil mediet virker helt fugtet. Lad hætteglasset sidde i et par minutter, og tilsæt om nødvendigt yderligere vand, indtil mediet er fuldstændig hydreret. Overfladen skal være fugtig med et skinnende udseende, og der må ikke være mellemrum i mediet. Hvis mediet ikke er fuldstændig hydreret, er produktionen af kraftige kulturer i fare. Fluer kan tilsættes få minutter efter, at mediet er blevet hydreret. Husk at tilsætte flere korn (men ikke mere) gær til medieoverfladen, før der tilsættes fluer.

Kogte medier
Når kogte medier doseres, skal de fylde kulturglasset, flasken eller hætteglasset 1/5 til 2/5 fuldt. Hold mediet ude natten over for at hærde, og hold hætteglassene tildækket med stof for at forhindre vilde fluer i at lægge æg i dem. Næste dag tilsættes gær og plugs. De ubrugte medieflasker skal opbevares i køleskab. Kogte medier kan opbevares i køleskabet i flere uger. Lad medierne varme op til stuetemperatur, inden der tilsættes fluer. Medierne må ikke tørre ud.
Miljø
Den nemmeste måde at dyrke fluer på er ved stuetemperatur. De optimale opdrætsbetingelser er dog en temperatur på 25 °C og en luftfugtighed på 60 %. Under disse forhold er generationstiden kortere (9-10 dage fra æg til voksen). Medmindre udstyr er let tilgængeligt, er dette unødvendigt for en vellykket opdræt og krydsning af fluer. Det er at foretrække at holde fluerne ude af træk og direkte sollys eller varmekilder. Disse vil hurtigt udtørre mediet, hvilket kræver hyppige skift af medie og potentielt kan dehydrere fluerne.
Bedøvelse af fluer
Problemet med frugtfluer er, at de flyver! Derfor er der udviklet en række forskellige metoder til bedøvelse af fluer. Heriblandt er æter, kommercielle mærker som Flynap, kuldioxid og afkøling. Hver metode har sine styrker og svagheder. Æter er brandfarlig, har en stærk lugt og dræber fluerne, hvis de bliver for meget bedøvet (og kan bedøve yngre elever!). Flynap, fra Carolina Biological, er rodet og har en lugt, som nogle finder ubehagelig. Hver af disse kræver imidlertid billigt udstyr, som let kan købes. Kuldioxid virker meget godt og holder fluerne ubevægelige i lange perioder uden bivirkninger, men CO2-måtter (blokke) er dyre, og der er behov for en CO2-kilde (normalt en flaske) og et leveringssystem (hætteglas og klemmer), hvilket øger omkostningerne. Hvis man er opfindsom, kan man bruge den CO2, der udsendes fra Alka-Seltzer-tabletter, til at bedøve fluerne i korte perioder. Opstil et stort reagensglas med et rør- og proppesystem. Tilsæt vand i røret og derefter Alka-Seltzer-tabletten. Der vil blive udsendt kuldioxidgas.

Det mindst skadelige for fluerne er enten kuldioxid eller køling bedøvelse. Af disse to muligheder er afkøling det enkleste, idet det kun kræver en fryser, is og petriskåle. Desuden er det den eneste metode, der ikke påvirker fluernes neurologi, og derfor kan adfærdsundersøgelser påbegyndes, efter at fluerne er blevet tilstrækkeligt opvarmet.
bedøvelse af fluerne ved afkøling
For at gøre fluerne ukampdygtige anbringes kulturglasset i fryseren, indtil fluerne ikke bevæger sig, som regel 8-12 minutter. Smid fluerne ud på en afkølet overflade. Dette kan konstrueres ved at bruge toppen af en petriskål, tilsætte knust is og derefter placere bunden af petriskålen ovenpå. Ved at lægge fluerne i dette system holdes de afkølede længe nok til at udføre hvert forsøg. Fluerne skal blot anbringes tilbage i dyrkningsglasset, når de er færdige. Fluerne “vågner” relativt hurtigt, når de ikke længere er på is, så hold dem kolde. Der er ingen langvarige bivirkninger ved denne metode, selv om fluer, der efterlades for længe i køleskabet, måske ikke kommer sig igen. En anden måde at holde fluerne kølige på er at tilsætte vand til fryseposer af zip-lock-typen, lægge dem i fryseren med en petriskål i posen og lade dem fryse ned.
Overførsel af fluer fra et hætteglas til et andet
Fluer bør overføres hver 10. til 14. dag. Eleverne bør opbevare en reservekultur af deres fluer, og instruktøren bør opbevare reservekulturer af alle fluestammer. Der er to grundlæggende måder at overføre fluer på, når der dannes nye kulturer. Den ene kræver ingen bedøvelse, men hurtige hænder.
A) Placer en tragt i mundingen af en frisk kulturflaske, hvor der allerede er tilsat medie. I det gamle hætteglas (det med fluer i) bankes fluerne forsigtigt ned ved at trampe hætteglasset blødt ned på en blød overflade, f.eks. en musemåtte. Fluerne vil falde til bunds og forblive der i et par sekunder (ikke mere end det!), hvilket er tid nok til hurtigt at tage proppen af hætteglasset, vende det i tragten og forsigtigt stampe de to hætteglas sammen for at tvinge fluerne ned i det nye hætteglas.
B) En alternativ måde er at lægge fluerne i fryseren i ca. 8 minutter. Dette vil få fluerne til at falde i en tilstand af bedøvelse. Efter at have sat en tragt på det nye hætteglas, vendes hætteglasset med ubevægelige fluer ned i tragten. Dette er ikke så sjovt, men du vil ikke have nogen fluer, der flyver rundt i klasseværelset.
Kønsbestemmelse af fluer
Det er ret nemt at skelne hanner fra hunner, og med lidt øvelse vil eleverne blive sikre på deres evne til at gøre det. Læg mærke til, at hanner generelt er mindre og har en mørkere og mere afrundet bagkrop. Farvningen af bagkroppen er den nemmeste at genkende. Desuden har hannerne tarsale kønskamme på deres første par ben. De er sorte og meget karakteristiske, men kan kun ses under forholdsvis kraftig forstørrelse. Med lidt øvelse vil eleverne ved at kigge på bagkroppen blive dygtige til at bestemme fluernes køn nøjagtigt. Kønsbestemmelse af fluer er afgørende, når der foretages krydsninger, så sørg for, at eleverne er sikre på at kunne identificere forskellen mellem kønnene. For at eleverne skal føle sig trygge ved at kønsbestemme fluer, skal du give dem eller få dem til at skaffe 25 fluer af blandet køn eller mere og lade dem sortere fluerne i to bunker, hanner og hunner. De andre elever i gruppen og instruktøren bør kontrollere sorteringen. Hvert medlem af gruppen skal være i stand til at kønsbestemme fluerne.
Billeder af hanner og hunner

Bemærk hannens mørkere bagkrop og mere afrundede udseende. Hunnerne har også en tendens til at være større.
Indsamling af jomfruhunner
Selv om det er et simpelt spørgsmål om at placere jomfruhunner sammen med hanner, er det vigtigt at erkende den tidsfaktor, der er involveret i at skaffe jomfruhunner. Hunnerne forbliver jomfruer i kun 8-10 timer efter udsætning og skal indsamles inden for denne tidsramme. BEMÆRK: Hunnerne har evnen til at lagre sæd efter en enkelt parring, så hvis hunnen til en krydsning ikke er jomfru, vil du ikke kende genotypen af den han, der anvendes til din krydsning. Det anbefales kraftigt, at du anskaffer dig ekstra jomfruer i tilfælde af, at der sker en fejl ved identifikationen, eller at fluen dør, før parringen og æglægningen kan finde sted. I en stærk kultur bør det være let at få flere jomfruhunner. Selv om hunnerne er i stand til at lægge æg som jomfruer, vil de være sterile, og der vil ikke blive produceret larver. Nedenfor er der tre måder at opnå jomfruer på, idet “fjernelsesmetoden” er den mest opmuntrende for begyndere.
Fjernelsesmetoden
Fjern alle fluer 8-10 timer før indsamling (normalt gøres dette først om morgenen). Kontroller overfladen af fødevarerne visuelt for at sikre, at alle fluer er fjernet. Efter 8-10 timer (normalt inden du forlader arbejdet) indsamles alle hunner, der er til stede. Alle vil være jomfruer. Anbring dem i et nyt dyrkningsglas og vent 2-3 dage for at se efter larver. Jomfruhunner kan lægge æg, men de vil være sterile. Da de er fotoperiodfølsomme, har hunnerne en tendens til at lukke sig tidligt om morgenen. Derfor vil tidlige indsamlinger sikre det største antal jomfruer til forsøg. Det er dog muligt at indsamle senere på dagen.
Visuel metode
Da man kan genkende jomfruhunner, er det ikke længere nødvendigt at tømme dyrkningsglassene rettidigt, og det giver eleverne mulighed for at indsamle deres egne uden at skulle komme til undervisningen på ulige tidspunkter af dagen. Bemærk, at jomfruhunner er meget større end ældre hunner og ikke har den mørke farvetegning, som voksne hunner har. Desuden vil der i de tidlige timer efter udslæt være synlig en mørk grønlig plet (meconium, resterne af deres sidste måltid før forpupning) på undersiden af bagkroppen.
Temperaturcykling
Det er muligt at maksimere antallet af jomfruer i en morgensamling ved at anvende temperaturcykling. Når kulturerne holdes ved en temperatur på 18°C, bremses udviklingen, så hunnerne ikke parrer sig før 16 timer efter indkapslingen. Ved at fjerne fluerne om eftermiddagen/aftenen og placere glassene i en 18°C inkubator vil 98% af de fluer, der opnås om morgenen, være jomfruer. Ved at placere jomfruer i deres egne hætteglas i 2-3 dage fjernes de 2%, der ikke er jomfruer.
Billeder af jomfruhanner og -hunner:

Krydsningsfluer
Når hunnerne anses for jomfruhanner, tilføjes hanner. Når der etableres krydsninger, er et forhold på 3:1 mellem jomfruhunner og hanner ideelt. Generelt vil hanner parre sig mere effektivt, hvis de har modnet 3 dage eller længere. Sørg for at vælge robuste, sunde hanner; jo ældre fluerne er, jo lavere er parringseffektiviteten. Parringen sker hurtigt, og adfærden er interessant at se på, men vil ikke blive behandlet her. Hunnerne begynder at lægge fertile æg kort efter parringen. Se skemaet over livscyklus for beviser for F1-larver. Fjern voksne, når det er konstateret, at der er tilstrækkeligt mange larver til stede (typisk 7-8 dage efter krydsningen), da du måske ikke kan skelne forældre fra F1-generationen.
Dræbende fluer: Dette er en uheldig nødvendighed, når man bruger fluer. Man bruger normalt en flaske eller et bægerglas med sæbevand eller mineralolie. De bedøvede fluer smides direkte ned i sæbevandet eller mineralolien, hvor de drukner. En flaske (bægerglas eller en krukke med skruelåg) fyldt med ethanol eller isopropanol kan også bruges som lighus.
Grundlæggende nomenklatur og definitioner inden for Drosophila Genetik

Drosophila melanogaster-fluer har 4 kromosomer.
Genotypen skrives som:

Kromosom
Kromosom eller kromosom/kromosom

Denne almindelige nomenklatur viser et kromosom øverst og dets homolog nederst, som kromosomerne ville se ud under meiosen, når de bidrager til kønsceller.

Når genotypen skrives, adskilles kromosomer generelt med et semikolon.

X-kromosom; kromosom II; kromosom III; kromosom IV

Vildtype betegnes som “+” eller WT

Dominante mutationer skrives med et stort bogstav:
For eksempel: For eksempel: Bar eller B

Recessive mutationer skrives med et lille bogstav:
For eksempel: White eller w

Mutationer er alleler (alternative former af et gen, der besætter et givet locus på et kromosom), der nedarves med kromosomer.

Homozygot – Et individ med samme allel på tilsvarende loci på de homologe kromosomer.

Heterozygot – Et individ med forskellige alleler på tilsvarende loci på de homologe kromosomer.

Genotype – De gener, som en organisme besidder.

Phenotype – De observerbare egenskaber ved en organisme.

P1 – Forældregeneration.

F1 – Filialgeneration eller afkomsgeneration. F1 er den første afkomsgeneration.

F2 – Den anden afkomsgeneration.
Andre gode webressourcer:

Gerard Manning har skrevet en simpel introduktion til Drosophila genetik.

Genetik på fluen: A Primer on the Drosophila Model System af Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem af David Bilder og Kenneth D. Irvine (2017).