Sammenligning af DNA-mængde og -kvalitet ved hjælp af spytindsamling efter indtagelse af mad og drikkevarer

Materialer og metoder

Vi har fået godkendelse fra Air Force Research Laboratory’s Human Subject Protection Institutional Review Board, protokolnummer FWR20180101H. Forsøgspersoner blev briefet individuelt og underskrev samtykkedokumenter, der blev bevidnet af en tredjepart. Prøver blev indsamlet fra fem forsøgspersoner ved hjælp af Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) og Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Alle indsamlede prøver blev indsamlet samme dag med mindst 30 minutter mellem hver indsamling eller i løbet af 3 dage på grund af deltagernes tidsbegrænsninger. Der blev indsamlet to svaberprøver pr. forsøgsperson; hver svaber blev gnedet mod indersiden af hver kind i 10-15 s. Der blev indsamlet seks spytprøver: i henhold til producentens anvisninger, umiddelbart efter at have drukket vand, spist frokost, drukket en sodavand med kulsyre, drukket en sportsdrik eller drukket kaffe.

Svaberprøverne blev ekstraheret ved hjælp af Epicentre QuickExtract™ DNA-ekstraktionsopløsning 1.0 (Epicentre). Den første vatpind blev behandlet som den er, og den anden blev renset ved hjælp af Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) under anvendelse af mikrocentrifugeprotokollen til rensning af genomisk DNA fra vævskulturcellelysater. Der var ingen cellevasketrin, fordi prøverne allerede var i opløsning. Spytprøverne blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) med producentens modificerede spytekstraktionsprotokol.

Prøverne blev kvantificeret ved hjælp af NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) og Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) med Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. NanoDrop blev også brugt til at vurdere renheden af prøverne ved at sammenligne absorbansværdierne ved 260 og 280 nm (A260/A280). Begge blev anvendt i henhold til producentens protokoller. Ekstraherede prøver, normaliseret til 10 ng/μL baseret på Qubit-koncentrationer, blev analyseret ved hjælp af en 2 % E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific). Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) sammen med High Sensitivity DNA Chip blev brugt til at bestemme kvaliteten af det ekstraherede DNA.

Proverne blev derefter analyseret på Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) for at teste for to genetiske markører, der er forbundet med jordnøddeallergi: rs7192 og rs9275596 . Genotypebestemmelse med hurtig rampe før polymerasekædereaktion (PCR) indstilling på 60 °C i 1 min, en holdcyklus på 95 °C i 10 min, 40 cyklusser på 95 °C i 15 s og derefter 60 °C i 1 min og en post-PCR ved 60 °C i 1 min. Der blev anvendt TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). SNP-assays (single nucleotide polymorphism) blev anvendt med halvdelen af den af producenten anbefalede koncentration. Det endelige volumen var 10 µL.

Resultater

Svaberekstraktionsmetoden ved hjælp af QuickExtract-opløsningen resulterede i en stor mængde DNA. Værdierne af DNA, der blev opnået fra vatpinden uden yderligere behandling, varierede fra 1,38 til 54,2 pg/µL, som bestemt af Bioanalyzer (Additional file 1: Tabel S1). Tidligere ikke-rapporterede resultater fra vores laboratorium viste imidlertid, at sekventeringseksperimenter blev hæmmet, når biblioteker blev fremstillet direkte fra QuickExtract-opløsningsekstraktioner. Derfor rensede vi disse prøver ved hjælp af en Wizard-kolonneoprensningsprotokol, hvilket sænkede koncentrationen som forventet (fra 2,59 til 38,2 pg/µL) og forbedrede A260/A280-forholdet til tættere på det generelt accepterede område (1,8-2,1).

Spytprøver indsamlet i henhold til producentens protokol og ekstraheret ved hjælp af QIAamp Blood DNA Kit havde et interval på 1,01 ng/μL til 8,20 ng/μL. Renheden angivet ved A260/A280-måling var typisk inden for intervallet for DNA (se Additional file 1: Tabel S1). Ingen af de spytprøver, der blev indsamlet, efter at forsøgspersonerne havde drukket forskellige drikkevarer eller spist frokost, viste DNA-koncentrationer og renhedsmålinger, der var signifikant forskellige fra dem, der blev indsamlet ved hjælp af producentens protokol (30 minutters faste) (fig. 1).

Ekstraherede prøver normaliseret til 10 ng/μL som bestemt ved Qubit 4.0-aflæsninger blev kørt på en 2 % E-Gel med en 1-kb ladder (Additional file 1: Figur S1). Vi forventede at se et bånd mod toppen af gelen, der repræsenterer en DNA-ekstraktion med høj molekylvægt. Som forventet var det ekstraherede DNA fra de forskellige spytindsamlingsmetoder af høj molekylvægt. Selv om de blev normaliseret til et 10-ng/µL input, resulterede de fleste af svaberprøverne ikke i et klart bånd, hvilket enten tyder på tilstedeværelsen af ladningsinterferenser eller et andet systematisk problem.

En mere detaljeret analyse af størrelse og renhed på en Bioanalyzer viste, at alle prøver og alle betingelser overvejende havde DNA med høj molekylvægt og lignende koncentrationer (Fig. 2). Bortset fra den førnævnte lave koncentration efter rensning af svaberekstraktionen er der ingen indsamlingsbetingelser (spise eller drikke) relaterede tendenser i DNA-kvalitet, -størrelse eller -koncentration, som bliver tydelige ved analyse af elektroferogramsignalerne. Der synes at være en emneafhængig ændring, selv om dette fænomen ikke blev undersøgt nærmere.

Sluttelig brugte vi SNP-genotypning til at teste egnetheden af det ekstraherede DNA til nedstrøms molekylære processer (fig. 3). Alle de ekstraherede prøver fra alle emner var med succes i stand til at producere brugbare resultater til genotypning af to SNP’er, der er forbundet med jordnøddeallergi , med undtagelse af en af de rensede svaberprøver (emne 5B).

Diskussion

Når man udformer en genetisk forskningsundersøgelse, et kommercielt produkt eller et sundhedsindgreb, er brugervenlighed og slutbrugernes overholdelse af reglerne to kritiske overvejelser. Blodindsamlingsudstyr, der kræver hudprikker, kan have en lavere compliance på grund af aversion mod smerte. Ud fra observationer i vores laboratorium har vi anekdotisk bemærket en lavere tilmeldingsrate i undersøgelser, når den primære forskel er venepunktur i forhold til spytprøvetagning. Vi har ikke foretaget en kontrolleret undersøgelse for at undersøge dette fænomen; vi har i stedet valgt at fortsætte med spytprøvetagning på grund af brugervenligheden, den tilsyneladende øgede tilmelding og den type forskningsundersøgelser, der overvejende udføres i vores laboratorium. Da vores undersøgelser indebærer selvadministration af spytprøverne, har vi forsøgt at fastslå, om der er tilstrækkelig stor mængde og kvalitet af DNA til brug i efterfølgende molekylære anvendelser efter forskellige sandsynlige indsamlingsbetingelser i felten, primært forskellige føde- og drikkevareindtag. Undersøgelsesdesignet var ikke beregnet til krydssammenligning mellem individer; vi søgte snarere at sammenligne variabiliteten af prøveudtagningen inden for samme forsøgsperson. Med dette mål for øje observerede vi ikke noget signifikant fald i DNA-mængder forårsaget af variation fra producentens instruktioner om at faste i 30 minutter før indsamling.

Men selv om mængden af DNA er vigtig, er kvaliteten af det opnåede DNA mere kritisk for avancerede molekylærbiologiske teknikker. I vores undersøgelse fandt vi, at indsamling af spytprøver efter at have spist og drukket ikke havde indflydelse på udbyttet af DNA med høj molekylvægt. Sådant DNA er afgørende for næste generations sekventering, array-scanning og PCR-genotypering. Desuden viste en eksperimentel test med to uafhængige genetiske mål i PCR-genotypning, at disse prøver var egnede til molekylære analyser.

Vores tilsigtede mål med denne undersøgelse var at se, om kvaliteten og mængden af DNA fra spytopsamling ved hjælp af et spyt DNA-opsamlingssæt ville blive påvirket af ikke at følge producentens anvisninger, dvs. at drikke eller spise lige før opsamling. I overensstemmelse med vores hypotese kunne vi ikke se nogen forskel i kvantitet eller kvalitet af det isolerede DNA.

Slutning

Genetiske undersøgelser har udvidet sig ud over det rent videnskabelige område og er nu almindelige blandt forbrugeren. For at optimere humane prøver til disse undersøgelser bestræber producenterne sig på at udvikle enkle og robuste indsamlingsmetoder. Spytprøveudtagning er den mindst invasive af disse metoder, giver DNA af høj kvalitet og en fremragende produktstabilitet. Vores undersøgelse af DNA fra spyt efter indtagelse af forskellige drikkevarer og/eller snacks har vist, at der ikke er nogen væsentlig forskel i mængden og kvaliteten af det DNA, der indsamles ved hjælp af Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix), når prøverne ikke indsamles i henhold til producentens protokol. Selv om stikprøvestørrelsen i denne undersøgelse er lille, er observationer fra andre undersøgelser i vores laboratorium i overensstemmelse med resultaterne af vores systematiske sammenligning, der præsenteres her. Vi konkluderer derfor, at spytindsamling er en robust, ikke-invasiv måde at indsamle prøver på både i laboratoriet og i felten, og at kravet om 30 minutters afholdenhed fra mad og drikkevarer er et ideal og ikke et absolut krav.