PMC

Syre (O2) udvikles under fotosyntetisk elektrontransport, når vand spaltes af det iltudviklende kompleks for at give protoner og elektroner til den kloroplastiske elektronkæde og derved generere ATP og NADPH – energikilden og den reducerende kraft for planternes stofskifte. Størstedelen af denne kemiske energi bruges til at drive fotosyntetisk kulstofmetabolisme, som består af ribulose-1,5-bisfosfatcarboxylering (fotosyntetisk kulstofreduktionscyklus) og oxygenering (fotosyntetisk kulstofoxidationscyklus); med et kombineret elektronbehov = JA. Der kræves fire elektroner for hver O2, der udvikles, således at bruttoproduktionen af O2 (GOP) er relateret til den lineære elektrontransport (J) i henhold til J/4. Når lineær elektrontransport kun anvendes til at drive CO2-fiksering, er forbruget af O2 og frigivelsen af CO2 ved fotosyntetisk kulstofoxidation og mitokondriel respiration sådan, at netto O2-produktion (NOP) er lig med netto CO2-assimilation (Anet; forudsat at respirationskvotienten er 1, men se Tcherkez et al, 2017).

Dertil kommer, at elektroner kan anvendes til alternativ ikkecyklisk elektrontransport (ANCET), herunder f.eks. fotoreduktion af O2 selv, der danner reaktive oxygenarter (Mehler-peroxidase-reaktioner eller “vand-vandcyklus”; Asada, 1999), chloroplastisk anabolisme (f.eks. lipider; Stumpf et al, 1963), reduktion af oxaloacetat til malat (som eksporteres til mitokondrierne; Scheibe, 2004) og kvælstofassimilation (Bloom et al., 1989). ANCET er blevet antaget både som en måde at regulere ATP/NADPH-forholdet på for at opfylde de skiftende energibehov i det cellulære stofskifte og som en mekanisme til at forhindre fotoskader ved at udnytte overskydende reduktant, når fotonfluxtætheden overstiger energibehovet for CO2-fiksering (f.eks. under høj bestråling, kolde temperaturer, vandstress, der lukker stomata; f.eks. Badger, 1985; Ort og Baker, 2002; Robinson, 1988). Det er vigtigt, at der ikke er noget formelt bevis for, hvordan elektronstrømme interagerer, især under fluktuerende lysforhold (Morales et al., 2018).

Da ANCET gør det muligt at opretholde større hastigheder af lineær elektrontransport, vil den samlede elektrontransport (Jt) være større end JA. Omvendt vil effekten på O2-optagelse være afhængig af den involverede metaboliske vej. I Mehler-peroxidasereaktionerne er der f.eks. ingen nettoændring i O2, så NOP vil forblive lig med Anet. Men ved reduktion af nitrat er forholdet mellem N-bundet O2-produktion og O2-forbrug stærkt afhængig af den syntetiserede aminosyre (Noctor og Foyer, 1998). I dette tilfælde vil NOP ikke altid være lig med Anet, fordi O2 og CO2 måske ikke er afbalanceret i metabolismen (Skillman, 2008). Derfor er samtidige målinger af CO2- og O2-strømme vigtige for forståelsen af, hvordan planter regulerer brugen af lysenergi, idet forskellige skæbner har meget forskellige metaboliske resultater.

De tidligste målinger af O2-udviklingen var ikke i stand til at skelne GOP fra optag af O2 (Hill, 1937). Den massespektrometriske metode, der blev etableret af Mehler og Brown (1952), løste dette problem ved at anvende O2-isotoptracere til uafhængigt at overvåge strømmene af 16O2 og 18O2. Ved denne metode blev der tilført ren 18O2 til gashovedrummet i et lukket kammer, og faldet i 18O2 blev henført til O2-optagelse. O2, der udvikles, har samme isotopiske sammensætning som det vand, det dannes af; i dette tilfælde var den dominerende isotop i vandet 16O (fig. 1). 18O-mærkningsmetoden blev yderligere anvendt på bladskiver (f.eks. Tourneux og Peltier, 1995), hele udskårne blade (f.eks. Volk og Jackson, 1972) og hele planter (Gerbaud og André, 1980), hvilket belyste O2’s skæbne in vivo.

Begrænsningen ved lukkede gasudvekslingssystemer er, at der kun kan foretages målinger i korte perioder (sekunder til minutter), før CO2-koncentrationen er opbrugt. Som følge heraf er CO2:O2 ikke konstant, hvilket ændrer de relative carboxylerings- og oxygeneringshastigheder, således at skøn over GOP- og O2-optagelsen vil være unøjagtige. Denne begrænsning blev overvundet i massespektrometritilgangen ved at erstatte CO2-forbruget ved periodisk tilstrømning af CO2 til kammeret, hvilket giver mulighed for steady-state kvantificering og udvider muligheden for at måle O2-floder under en række betingelser og fysiologiske tilstande (Canvin et al., 1980). Samtidig blev der gjort fremskridt i brugen af klorofylfluorescens, som giver oplysninger om PSII-kvanteudbyttet (Baker, 2008). Genty et al. (1989) leverede den empiriske forbindelse mellem fluorescens og elektrontransporthastighed, hvilket erstattede behovet for at måle O2-udviklingen direkte. Klorofylfluorescens er nu en af de mest populære teknikker inden for plantefysiologi på grund af dens brugervenlighed og relativt lave omkostninger. Dette er blevet understøttet af muligheden for at multiplexe fluorescensmålinger med H2O- og CO2-gasudveksling i bærbare, kommercielt tilgængelige instrumenter, hvilket åbner mulighed for at måle plantefunktioner uden for laboratoriet. Følgelig er in vivo-målinger af O2-fluxer faldet betydeligt i løbet af de sidste 20 år.

I dette nummer af Plant Physiology minder Gauthier et al. (2018) os om, hvorfor det er så vigtigt at vende tilbage til O2 og giver os et nyt, elegant open-path-system til at måle O2-fluxer. Deres metode er en “omvendt” isotopisk tilgang, der involverer 18O-mærkning af bladvand i stedet for luft, således at den isotopiske sammensætning af O2, der udvikles under vandspaltning, har en signatur meget forskellig fra den omgivende O2 (Fig. 1). Det er absolut nødvendigt at anvende en betydelig 18O-berigelse, da bidraget fra NOP i en baggrund med 21% O2 sandsynligvis er i størrelsesordenen 0,05% (f.eks. 100 μmol mol-1 NOP/210.000 μmol mol-1 omgivende O2), hvilket gør det vanskeligt normalt at påvise en ændring i δ18O af O2 i forbindelse med NOP i luften omkring bladet.

Metoden er stadig meget teknisk og kræver brug af tre instrumenter med høj præcision. Den isotopiske sammensætning og koncentrationen af CO2- og H2O-damp måles ved hjælp af laserspektroskopi, og δ18O2 og δO2/N2 (for at estimere O2-koncentrationen) måles ved hjælp af massespektrometri. Der er også behov for et specialfremstillet kammer til at huse det udskårne blad og dets 18O-mærkede vandkilde, hvilket er med til at forhindre lækager over pakningerne fra omkring bladstilken. Det er vigtigt, at det åbne gasudvekslingssystem forbedrer evnen til at opnå steady-state-målinger, og mærkning af vand i forhold til brug af ren 18O2-gas løser spørgsmålet om prisbillighed, som i høj grad har begrænset vedtagelsen af åbne systemer.

Mens klorofylfluorescens er blevet den populære mulighed for måling af elektrontransporthastighed, er det ikke uden antagelser. For eksempel antages det ofte, at blade absorberer 84% af de indfaldende fotoner, og at 50% af disse fotoner absorberes af PSII; dette er dog ikke altid tilfældet (Baker, 2008). Dette kan føre til en overvurdering af elektrontransporthastigheden, når den beregnes ud fra fluorescens sammenlignet med målinger af GOP. Desuden er nøjagtig bestemmelse af JA særlig relevant for estimering af mesofyl konduktans, hvilket var en anvendelse, der blev fremhævet af Gauthier et al. (2018). Mehler-peroxidase-reaktionerne, som har vist sig at svinge fra 0 % til 30 % (Driever og Baker, 2011), ville føre til en overvurdering af elektronstrømme forbundet med de fotosyntetiske kulstofreduktions-/oxygeneringscyklusser i begge metoder. Fordelen ved isotopmærkningsmetoden er imidlertid, at Mehler-reaktionens bidrag til bruttoproduktionen af O2 kan kvantificeres ved at koble målinger af GOP med NOP (f.eks. Furbank et al., 1982; se fig. 1). Nu, hvor vi har en fornyet mulighed for at måle O2-strømme, bør disse antagelser ikke ignoreres.

Ud over at forstå afvejningen mellem effektivitet og fotobeskyttelse med henblik på forbedret landbrugsproduktion (Murchie og Niyogi, 2011) har de forskellige elektronskæbner vigtige implikationer for forståelsen af globale O2-strømme. Især har O2-optagelse i forbindelse med fotorespiration, mitokondriel respiration og Mehler-peroxidasereaktionerne forskellige isotopfraktioneringsfaktorer (Guy et al., 1993), således at kvantificering af de enkelte vejstrømme er nødvendig for at begrænse estimater af den globale primærproduktion ud fra δ18O-oplysninger (Welp et al, 2011).

Det er på høje tid, at vi genovervejer målingen af O2-strømme, og den nye metode udviklet af Gauthier et al. (2018) giver os den nødvendige kapacitet til at gøre det.