DNE’er I TRANSCRIPTIONEL REGULERING
DNE’er kan også opstå i forbindelse med transkriptionel regulering. Der kan f.eks. opnås en DNE ved at fjerne transaktiveringsdomænet af en modulær TF og kun efterlade DNA-bindingsdomænet. Denne trunkerede faktor kan opføre sig som en konkurrerende hæmmer af transkription. Det er kendt, at dette forekommer i naturen. F.eks. udtrykkes C/EBP-proteinet hos pattedyr som tre alternative polypeptider. De længere polypeptider indeholder et N-terminalt transkriptionelt aktiveringsdomæne, mens den korte form mangler det. Da de lange og korte isoformer samles til homo- og heterodimere, opfører sidstnævnte sig som en naturlig DN (Zahnow et al., 1997). Dette er også tilfældet for Stats 5 og 6 i hvirveldyr, som er i stand til at dimerisere. Deres proteolytiske behandling som reaktion på fysiologiske signaler fører til fjernelse af det C-terminale aktiveringsdomæne og omdanner dem til kraftige inhibitorer, der regulerer signaltransduktionen negativt (Nakajima et al., 2003). I planter fungerer et stort antal MYB-proteiner som transkriptionelle regulatorer. I Arabidopsis er proteiner, der indeholder en enkelt MYB DNA-bindende gentagelse, men mangler transaktiveringsdomænet, involveret i at specificere aspekter af epidermal celleskæbne. Disse proteiner interagerer med andre TF’er, herunder bHLH-proteiner, og på grund af fraværet af et transaktivatordomæne opfører de sig som DN og trans-DN’er ved at danne inaktive komplekser (Ramsay og Glover, 2005).
Fjernelse af det DNA-bindende domæne kan også føre til DNE’er. Dette sker i bHLH TF’er. Som nævnt ovenfor koder Id-1-genet for en naturligt forekommende DN-inhibitor af denne familie af TF’er. Komplette bHLH-proteiner (med DNA-bindings- og dimeriseringsdomæner) kan udtrykkes konstitutivt. Den regulerede ekspression af Id-1, der kun indeholder dimeriseringsdomænet, pålægger imidlertid en regulering af bHLH-proteinaktiviteten (Sun, 1994). Et lignende fænomen forventes også i planter. For eksempel koder genomet af Arabidopsis for ∼120 bHLH-proteiner, der forudsiges at binde DNA, og 27 proteiner med en mindre basisk region, end der kræves til binding (Toledo-Ortiz et al., 2003). Disse ikke-DNA-bindende HLH’er kan fungere som animalske Id-proteiner, som negative regulatorer af bHLH-proteiner gennem dannelse af heterodimere, der ikke er i stand til at binde DNA (Toledo-Ortiz et al., 2003). Lignende virkninger forventes i TF’er, der tilhører basisk domæne/leucine zipper (bZIP)-familien, som indeholder et basisk DNA-bindingsmotiv, et leucine zipper dimeriseringsdomæne og domæner til transaktivering. Arabidopsis koder for 67 bZIP-proteiner, som alle er forudsagt til at fungere som homo- og/eller heterodimere (Deppmann et al., 2004). Nogle af disse er meget små og mangler muligvis aktiveringsdomæner. I et klassisk eksempel i planter belyste Fukazawa et al. (2000) funktionen af bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) i gibberellin-signalering ved hjælp af en DN-form af RSG, som manglede et transkriptionelt aktiveringsdomæne og derfor virkede til at undertrykke funktionen af wild-type proteinet, når det blev udtrykt i transgene tobak. I overensstemmelse med det, der er blevet sagt i afsnittet om trans-DN’er ved overekspression, er DNA-protein-transkriptionskomplekser desuden også følsomme over for gen-doseringsbalancen (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Ændringer af denne balance ved nedsat eller øget ekspression af en TF i forhold til andre, der er involveret i det samme kompleks, kan fremkalde unormale fænotyper.
En simpel model for transkriptionel aktivering kan bruges til at undersøge nogle kvantitative finesser ved DN-mutationer i denne sammenhæng. Undersøgelser af virale systemer og Drosophila har vist, at transkription ofte viser et sigmoidalt forhold med hensyn til koncentrationen af en TF. I tilfælde af et system, der reagerer på en enkelt type aktivator (A), kan dette sigmoidale respons opdeles i to hovedkomponenter: kooperativ binding af A til promotoren (p) af et målgen og synergi (figur 6). Synergi er resultatet af de samordnede interaktioner mellem de molekyler af A, der allerede er bundet til promotoren, og transkriptionsmaskineriet (Carey, 1998; Veitia, 2003).
DNE’er i transkription.
(A) Promotor med to bindingssteder (grå trekanter), der genkendes på en kooperativ måde af aktivatoren A eller dens afkortede form a, der opfører sig som en kompetitiv inhibitor.
(B) Kooperativiteten kan skyldes den samordnede tiltrækning af en indkommende monomer fra A, der sidder på DNA’et og et nabo-DNA-sted.
(C) Synergi: to monomerer, der sidder på deres DNA-bindingssteder, vil tiltrække polymerasen (pol) meget stærkere end kun én monomer, der er bundet til DNA’et. Synergien forstyrres, når en monomer mangler det polymerase-rekrutterende domæne.
Tænk på en promotor, p, der indeholder to bindingssteder for A. De samme bindingssteder genkendes også af varianten a, der kan virke som en konkurrerende inhibitor. Vi antager, at der kan være samarbejdsvilje under interaktionen mellem A-molekylerne og promotoren. Dette kan også være tilfældet for interaktionerne mellem A, a og promotoren. En mulig kilde til samarbejdsvilje blev nævnt ovenfor (dvs. at A har tendens til at danne dimerer i opløsning, men at dette forstærkes under DNA-binding). En anden mulighed er, at monomerer ikke er i stand til at interagere i opløsning, og at interaktion mellem en monomer og DNA fører til en allosterisk ændring, der øger affiniteten af bundet A for en indkommende monomer. Det er også muligt, om end mindre sandsynligt, at der ikke er nogen A-A-interaktioner, og at binding af en monomer til DNA fører til en ændring i nabostedet, der øger dets affinitet for en nyankommende monomer. Uanset hvad betyder kooperativitet, at reaktionen pA + A = pAA forekommer lettere end p + A = pA.
På grund af eksistensen af synergi er den molekylære art, der bidrager mest til transkriptionen, promoteren, der er besat af to molekyler aktivator: pAA. Dette betyder også, at hvis affinitetskonstanten for forbindelsen mellem komplekset pA og polymerasen er KpolA, vil K for forbindelsen mellem pAA og polymerasen være meget højere end 2K (i størrelsesordenen K2polA; se Zlotnick, 1994). For at tage højde for delvis transaktiveringsaktivitet i denne model vil vi anvende Kpola (for reaktionen pa + pol) og Kpola2 (for paa + pol). Under disse antagelser kan der udledes en ligning for transkriptionssvaret (TR) som funktion af koncentrationen af A (og a) som beskrevet af Veitia (2003) og Veitia og Nijhout (2006) (se Supplerende materialer online).
Med en ret enkel ligning i hånden kan flere betingelser undersøges: (1) wildtypesituationen A/A, (2) når der er en manglende allel (A/-), og (3) når der er coekspression af A og en trunkeret version a, der mangler transaktiveringsdomænet. I sidstnævnte tilfælde kan vi skelne mellem to forskellige situationer: (3a), når mutationen af a ophæver kooperativiteten, eller (3b), når A og a interagerer kooperativt. Endelig kan vi også undersøge en situation (4), hvor transaktiveringskapaciteten af a er normal og kooperativiteten fraværende, og (5), hvor kooperativiteten er normal, men transaktiveringskapaciteten er delvis.
Figur 7 viser, at a TR i forhold til promotorens maksimale output versus udviser et sigmoidalt forhold, der ligger mellem 0 og 1. Mætning afspejler systemets maksimale respons, men det betyder ikke, at promotoren kun fungerer ved mætning. Ifølge figuren og generelt er værdierne på kurven for heterozygoten A/- på ethvert punkt lavere end hos A/A (for hver værdi af relativ , har heterozygoten A/- to gange mindre i absolutte tal end vildtypen). Interessant nok er forskydningen mellem kurverne ved lave relative koncentrationer af A meget udtalt Y(A/-) er ∼25% af Y(A/A). Men som intuitivt forventet nås mætning for høje værdier af A også i A/-. Hvis dette system var normalt funktionelt ved lave koncentrationer af A, ville et individ A/- vise en typisk haploinsufficient fænotype.
TR for en promotor (med to steder) til aktivatoren A alene eller samudtrykt (i ækvimolære mængder) med dens DN-form a.
Den graf repræsenterer TR som en funktion af produktionen af A (a) pr. allel i forhold til et maksimalt output. Outputtet i form af koncentrationer af A (a) afhænger direkte af styrken (varigheden) af et signal, der driver produktionen af A (a). I det særlige tilfælde af heterozygoten A/- vil den for enhver værdi af x have to gange mindre A-protein end A/A. Således er værdierne af TR for heterozygoten A/- på et hvilket som helst tidspunkt (lyseblå) lavere end hos den normale A/A (mørkeblå), men for høje værdier af A nås mætning. I A/a, hvor a mangler transaktiveringskapacitet i mangel af kooperativitet mellem A og a, er der en tendens til at nå mætning med stigende koncentrationer af A og a, da førstnævnte har en tendens til at besætte promotoren ved kooperativt at rekruttere andre molekyler af A (lyserød). Når kooperativiteten mellem A og a opretholdes, nås kurvens plateau for A/a ved TR = 0,25 (grøn), da den transkriptionelt aktive art pAA kun udgør 25 % af den samlede mængde. Når der er resterende transaktivering, og kooperativiteten er normal, nås plateauet for A/a ikke ved TR = 1, men på et lavere niveau (rødt). Følgelig krydser kurven for A/a kurven for A/- kurven for A/a. Denne allel a er hypomorph, hvis systemet normalt fungerer ved lave mætningsniveauer af A og a, mens det er DN ved højere koncentrationer. Parametre findes i Supplemental Materials online.
Hvad sker der i A/a, når a mangler transaktiveringsdomænet i mangel af kooperativitet? I henhold til den klassiske DN-definition er kurven lavere på ethvert punkt end den for A/-. Der er imidlertid en tendens til at nå mætning med stigende koncentrationer af A og a. Faktisk har A en tendens til fortrinsvis at besætte promotoren, da det sikrer kooperative interaktioner med indkommende A-monomerer. Det er imidlertid tydeligt, at promotorgenkendelse ved lav proteinkoncentration sker mindre let i A/a end i wild-typetilstanden. I praksis vil en afkortet monomer, der ikke er i stand til at sikre kooperative interaktioner, føre til en svag DNE. Situationen er helt anderledes i den anden yderlighed, når samarbejdsviljen mellem A og a er fuldt ud opretholdt. Kurvens plateau for A/a nås faktisk ved TR = 0,25. Dette er forventeligt, fordi pAA, som driver transkriptionen (dvs. bidragene fra pAa og paa er ubetydelige), kun udgør 25 % af de besatte promoterarter ved mætning.
Et potentielt eksempel gives af en kunstig mutation i TF FOXL2. Denne TF undertrykker promotoren af det humane steroidogene akutte reguleringsgen, som indeholder flere formodede bindingssteder. En version af FOXL2, der indeholder DNA-bindingsdomænet, men mangler det C-terminale domæne, er i stand til at fremkalde en DNE, der forringer den transkriptionelle repression. Denne effekt opnås imidlertid kun, når DN-versionen er meget stærkere udtrykt (5× og 10×) end wild-type-proteinet (Pisarska et al., 2004). Som skitseret ovenfor kan dette skyldes manglende kooperative interaktioner mellem FOXL2-molekyler på denne promotor.
Et mere sigende eksempel findes i figur 8, som repræsenterer responsen af to forskellige promotorer, der indeholder et eller to bindingssteder for TF PTX2a og dens DN-version, som tidligere beskrevet (Saadi et al., 2003. Ved lave mængder transficerende DNA (0,05 μg i figur 8) er responset fra promotoren med to sites mere end to gange stærkere (dvs. 3×) end responset fra promotoren med kun ét site. Dette er den kombinerede signatur af samarbejdsvilje og synergi. Ved høje koncentrationer af transficerende konstruktioner WT+DN er TR af promotoren med to bindingssteder desuden ∼25 % af responsen af vildtypen alene. Dette er forventet, fordi dimere ved høj proteinkoncentration kan præassembleres, selv før de når mål-DNA’et. I dette tilfælde vil kun 25 % af dimererne være normale. Faldet i TR er mindre dramatisk for promotoren med kun ét bindingssted (forventet 50%). Ud fra et praktisk synspunkt bør man for at undgå at overse en potentiel DNE i in vitro-forsøg transficere små mængder af WT+DN-konstruktionerne med et overskud af reporterpromotor for at undgå, at den bliver mættet af wild-type-formen. Mere generelt bør der tilvejebringes responskurver for forskellige TF-koncentrationer til sådanne transfektionseksperimenter.
Respons af to forskellige kunstige promotorer (p) indeholdende et eller to bicoid-lignende bindingssteder for TF PITX2a og dens DN-version (K88E).
Solide linjer: Promotoraktivitet (luciferase-reporter-system) i tilstedeværelse af wild-type TF. Stiplede linjer: samekspression af vildtypen og dens DN-version. Bemærk, at ved lave mængder transficerende DNA er responset fra promotoren med to steder >2 gange stærkere (dvs. 3×) end responset fra promotoren med kun ét sted på grund af kooperativitet og synergi. Som forudsagt er TR af promotoren med to bindingssteder ved høje mængder af konstruktioner WT+DN ∼25% af responsen af vildtypen alene. Faldet i TR er, som forventet, mindre dramatisk for promotoren med kun ét bindingssted. Gengivet og ændret med tilladelse fra forfatterne og fra Molecular and Cellular Biology and the American Society for Microbiology (Saadi et al., 2003).
Som intuitivt forventet, når transaktiveringskapaciteten af a er normal og kooperativitet fraværende, forekommer der en meget mild DNE, der fører til en adfærd tæt på en nulallel i heterozygot tilstand. Isolering af denne type mutant er mulig ved hjælp af en elegant gærgenetisk screening beskrevet af Burz og Hanes (2001). En mutation kan påvirke niveauerne af kooperativitet mindre dramatisk. Et interessant tilfælde opstår, når kooperativiteten falder til ca. en tiendedel af det normale niveau (i henhold til de parametre, der ligger til grund for de resultater, der er præsenteret i figur 7), og transaktiveringskapaciteten er normal. Under disse forhold opfører varianten a sig som en hypomorphisk allel i homozygoten a/a og som en nulallel i A/a (dvs. A/a = A/-; data ikke vist). Dette fremhæver igen manglen på tydelige grænser mellem hypomofiske, DN- og nulalleler.
Når der er resterende transaktivering (dvs. 1<Kpola<KpolA), og kooperativiteten er normal, nås plateauet i A/a ikke ved TR = 1, men på et lavere niveau. Alleler med delvis aktiveringskapacitet kan i nogle tilfælde let produceres. Paradigmet er givet gær-TF Gal4, som indeholder to aktiverende regioner (ARI og ARII), der er involveret i rekrutteringen af transkriptionsmaskineriet. Deletioner i den sure region ARII fører til et fald i transaktiveringskapaciteten (Ptashne og Gann, 2002; Ptashne, 2007). En kombination af en sådan allel med wild-type Gal4 bør opføre sig som beskrevet. Som vist i figur 7 krydser kurven for A/a kurven med kurven for A/-. Den samme allel kan således være hypomorfe, hvis systemet fungerer ved lave mætningsniveauer (før kurverne skærer hinanden) og kan være DN i molekylær henseende ved højere proteinkoncentrationer. Der kan gives en intuitiv forklaring. Overvej f.eks. et protein a, der interagerer med polymerasen med f.eks. 90 % af vildtypestyrken. For et interval af koncentrationer vil heterozygoten A/a have en tendens til at opføre sig som A/A. Ved mætning vil kun 25% af promotorarten imidlertid være pAA, som interagerer med polymerasen med maksimal styrke. I modsætning hertil er det i en heterozygot A/- ved lave proteinkoncentrationer vanskeligere at besætte promotoren, mens 100 % af promotorarten ved mætning vil være pAA. Således må kurverne for A/a og A/- skære hinanden på et tidspunkt.
Alle målpromotorer i en celle er ikke lige følsomme over for en DN TF. Når der er stærk kooperativitet og synergi, bør følsomheden af en promotor over for et DN-protein afhænge af antallet af bindingssteder på DNA’et. Det enkleste tilfælde at visualisere er, når a mangler et transaktiveringsdomæne, men interagerer kooperativt med A. Hvis den promoterart, der driver transkriptionen, er den, der er fuldt belastet med wild-type-protein, som antaget ovenfor, kan den maksimale TR beregnes ved hjælp af formlen (af binomialsandsynlighederne), der er angivet i Supplemental Materials online. For en promotor med to identiske bindingssteder vil den maksimale TR være 25 % i forhold til output i wild-type-tilstand: for tre bindingssteder 12,5 %, og for fire bindingssteder 6,25 % (når A og a udtrykkes i ækvimolære koncentrationer). For mere komplekse situationer er svaret ikke intuitivt og kræver analyse af modeller, som ikke er behandlet her.