Komponenterne i et grundlæggende højtydende væskekromatografisystem er vist i det enkle diagram i figur E.
Et reservoir indeholder opløsningsmidlet . En højtrykspumpe anvendes til at generere og dosere en bestemt strømningshastighed af den mobile fase, typisk milliliter pr. minut. En injektor er i stand til at indføre prøven i den kontinuerligt flydende strøm af mobil fase, som fører prøven ind i HPLC-kolonnen. Kolonnen indeholder det kromatografiske pakkemateriale, der er nødvendigt for at foretage separationen. Dette pakningsmateriale kaldes den stationære fase, fordi det holdes på plads af kolonnens hardware. Der er brug for en detektor for at kunne se de adskilte forbindelsesbånd, når de elueres fra HPLC-søjlen . Den mobile fase forlader detektoren og kan sendes til affald eller opsamles efter ønske. Når den mobile fase indeholder et bånd af en separeret forbindelse, giver HPLC mulighed for at opsamle denne fraktion af eluatet, der indeholder den rensede forbindelse, med henblik på yderligere undersøgelse. Dette kaldes præparativ kromatografi.
Bemærk, at der anvendes højtryksslanger og fittings til at forbinde pumpe-, injektor-, søjle- og detektorkomponenterne for at danne en ledning for den mobile fase, prøven og de separerede forbindelsesbånd.
Figur E: Højtydende væskekromatografisystem
Detektoren er forbundet til computerdatastationen, som er den komponent i HPLC-systemet, der registrerer det elektriske signal, der er nødvendigt for at generere kromatogrammet på displayet og for at identificere og kvantificere koncentrationen af prøvebestanddelene (se figur F). Da prøveforbindelsernes egenskaber kan være meget forskellige, er der udviklet flere typer detektorer. Hvis en forbindelse f.eks. kan absorbere ultraviolet lys, anvendes en UV-absorbansdetektor. Hvis forbindelsen fluorescerer, anvendes en fluorescensdetektor. Hvis forbindelsen ikke har nogen af disse egenskaber, anvendes en mere universel type detektor, f.eks. en detektor til fordampningslysspredning . Den mest effektive metode er at anvende flere detektorer i serie. F.eks. kan en UV- og/eller ELSD-detektor anvendes i kombination med et massespektrometer til at analysere resultaterne af den kromatografiske separation. Dette giver fra en enkelt injektion mere omfattende oplysninger om en analysand. Praksis med at koble et massespektrometer til et HPLC-system kaldes LC/MS.
Figur F: Et typisk HPLC-system
HPLC-drift
En simpel måde at forstå, hvordan vi opnår adskillelsen af de forbindelser, der er indeholdt i en prøve, er at se på diagrammet i figur G.
Mobil fase kommer ind i kolonnen fra venstre, passerer gennem partikelbedet og kommer ud til højre. Strømningsretningen er angivet med grønne pile. Først betragtes det øverste billede; det repræsenterer kolonnen på tidspunktet nul , hvor prøven kommer ind i kolonnen og begynder at danne et bånd. Den viste prøve, en blanding af gule, røde og blå farvestoffer, vises ved indgangen til kolonnen som et enkelt sort bånd.
Efter nogle få minutter , hvor den mobile fase strømmer kontinuerligt og jævnt forbi partiklerne i pakningsmaterialet, kan man se, at de enkelte farvestoffer har bevæget sig i separate bånd med forskellige hastigheder. Dette skyldes, at der er en konkurrence mellem den mobile fase og den stationære fase om at tiltrække de enkelte farvestoffer eller analytter. Bemærk, at det gule farvestofbånd bevæger sig hurtigst og er ved at forlade kolonnen. Det gule farvestof kan lide den mobile fase mere end de andre farvestoffer. Derfor bevæger det sig med en højere hastighed, tættere på den mobile fases hastighed. Det blå farvestofbånd kan lide pakkematerialet mere end den mobile fase. Dets stærkere tiltrækning til partiklerne gør, at det bevæger sig betydeligt langsommere. Med andre ord er det den mest tilbageholdte forbindelse i denne prøveblanding. Det røde farvestofbånd har en mellemliggende tiltrækning til den mobile fase og bevæger sig derfor med en mellemliggende hastighed gennem kolonnen. Da hvert farvestofbånd bevæger sig med forskellig hastighed, er vi i stand til at adskille det kromatografisk.
Figur G: Forståelse af, hvordan en kromatografisk kolonne fungerer – bånd
Hvad er en detektor?
Når de adskilte farvestofbånd forlader kolonnen, passerer de straks ind i detektoren. Detektoren indeholder en flowcelle, der ser hvert separeret forbindelsesbånd mod en baggrund af mobilfasen . En passende detektor har evnen til at registrere tilstedeværelsen af en forbindelse og sende det tilsvarende elektriske signal til en computerdatastation. Der vælges mellem mange forskellige typer detektorer, afhængigt af egenskaberne og koncentrationerne af de forbindelser, der skal adskilles og analyseres, som tidligere omtalt.
Hvad er et kromatogram?
Et kromatogram er en repræsentation af den separation, der er sket kemisk i HPLC-systemet. En serie af toppe, der stiger fra en basislinje, tegnes på en tidsakse. Hver top repræsenterer detektorsvaret for en anden forbindelse. Kromatogrammet tegnes af computerdatastationen.
Figur H: Hvordan toppe dannes
I figur H er det gule bånd gået helt igennem detektorens flowcelle; det genererede elektriske signal er blevet sendt til computerdatastationen. Det resulterende kromatogram er begyndt at blive vist på skærmen. Bemærk, at kromatogrammet begynder, når prøven først blev indsprøjtet, og at det starter som en lige linje nær bunden af skærmen. Dette kaldes basislinjen; den repræsenterer den rene mobile fase, der passerer gennem flowcellen over tid. Efterhånden som det gule analytbånd passerer gennem flowcellen, sendes der et stærkere signal til computeren. Linjen kurverer først opad og derefter nedad i forhold til koncentrationen af det gule farvestof i prøvebåndet. Dette skaber en top i kromatogrammet. Når det gule bånd er passeret helt ud af detektorcellen, vender signalniveauet tilbage til grundlinjen; flowcellen har nu igen kun ren mobil fase i sig. Da det gule bånd bevæger sig hurtigst og eluerer først fra kolonnen, er det den første top, der tegnes.
Lidt senere når det røde bånd frem til flowcellen. Signalet stiger op fra basislinjen, når det røde bånd først kommer ind i cellen, og toppen, der repræsenterer det røde bånd, begynder at blive tegnet. I dette diagram har det røde bånd ikke passeret flowcellen helt. Diagrammet viser, hvordan det røde bånd og den røde top ville se ud, hvis vi stoppede processen på dette tidspunkt. Da det meste af det røde bånd har passeret gennem cellen, er det meste af toppen blevet tegnet, som det fremgår af den gennemgående linje. Hvis vi kunne starte igen, ville det røde bånd passere helt gennem flowcellen, og den røde top ville være færdiggjort . Det blå bånd, som er det stærkest tilbageholdte, bevæger sig med den laveste hastighed og elueres efter det røde bånd. Den stiplede linje viser, hvordan det færdige kromatogram ville se ud, hvis vi havde ladet kørslen fortsætte til dens afslutning. Det er interessant at bemærke, at bredden af den blå top vil være den bredeste, fordi bredden af det blå analytbånd, som er smallest på søjlen, bliver bredest, når det elueres fra søjlen. Dette skyldes, at den bevæger sig langsommere gennem det kromatografiske pakningsmateriale og kræver mere tid til at blive elueret fuldstændigt. Da den mobile fase flyder kontinuerligt med en fast hastighed, betyder det, at det blå bånd bliver bredere og mere fortyndet. Da detektoren reagerer i forhold til bandets koncentration, er det blå peak mindre i højden, men større i bredden.