Enzymkatalyse

Disse konformationsændringer bringer også de katalytiske rester i det aktive sted tæt på de kemiske bindinger i substratet, som vil blive ændret i reaktionen. Efter at bindingen har fundet sted, sænker en eller flere katalysemekanismer energien i reaktionens overgangstilstand ved at tilvejebringe en alternativ kemisk vej for reaktionen. Der er seks mulige mekanismer for “over barrieren”-katalyse samt en “gennem barrieren”-mekanisme:

Nærhed og orienteringRediger

Enzym-substrat-interaktioner retter de reaktive kemiske grupper ud og holder dem tæt sammen i en optimal geometri, hvilket øger reaktionshastigheden. Dette reducerer reaktanternes entropi og gør således additions- eller overførselsreaktioner mindre ugunstige, da der sker en reduktion i den samlede entropi, når to reaktanter bliver til et enkelt produkt. Dette er imidlertid en generel virkning og ses i ikke-additions- eller overførselsreaktioner, hvor den opstår som følge af en stigning i reagenternes “effektive koncentration”. Dette forstås, når man ser på, hvordan en stigning i koncentrationen fører til en stigning i reaktionshastigheden: Når reaktanterne er mere koncentrerede, støder de oftere sammen og reagerer derfor oftere. Ved enzymkatalyse begrænser reagensernes binding til enzymet reaktanternes konformationsrum og holder dem i den “rette orientering” og tæt på hinanden, således at de kolliderer hyppigere og med den rette geometri for at fremme den ønskede reaktion. Den “effektive koncentration” er den koncentration, som reaktanten skal have i fri opløsning for at opleve den samme kollisionsfrekvens. Ofte er sådanne teoretiske effektive koncentrationer ufysiske og umulige at realisere i virkeligheden – hvilket vidner om mange enzymernes store katalytiske kraft med massive hastighedsforøgelser i forhold til den ikke-katalyserede tilstand.

For eksempel:

Sammenlignende reaktioner vil ske langt hurtigere, hvis reaktionen er intramolekylær.

Den effektive koncentration af acetat i den intramolekylære reaktion kan estimeres som k2/k1 = 2 x 105 Molar.

Situationen kan dog være mere kompleks, da moderne beregningsmæssige undersøgelser har fastslået, at traditionelle eksempler på nærhedseffekter ikke kan relateres direkte til enzym-entropiske effekter. Det har også vist sig, at det oprindelige entropiske forslag i høj grad overvurderer orienteringsentropiens bidrag til katalysen.

Protonedonorer eller -acceptorerRediger

Protonedonorer og -acceptorer, dvs. syrer og baser kan donere og acceptere protoner for at stabilisere udviklende ladninger i overgangstilstanden. Dette hænger sammen med det overordnede princip for katalyse, nemlig at reducere energibarrierer, da overgangstilstande generelt er højenergitilstande, og ved at stabilisere dem reduceres denne høje energi, hvorved barrieren sænkes. En vigtig egenskab ved enzymkatalyse i forhold til mange andre ikke-biologiske katalyser er, at både syre- og basekatalyse kan kombineres i den samme reaktion. I mange abiotiske systemer kan syrer (store ) eller baser ( H+-sænkninger med stor koncentration eller arter med elektronpar) øge reaktionshastigheden; men miljøet kan naturligvis kun have én samlet pH (mål for surhed eller basiskhed (alkalinitet)). Da enzymer imidlertid er store molekyler, kan de placere både syregrupper og basiske grupper i deres aktive sted for at interagere med deres substrater og anvende begge tilstande uafhængigt af den samlede pH-værdi.

Ofte anvendes generel syre- eller basekatalyse til at aktivere nukleofile og/eller elektrofilgrupper eller til at stabilisere afgangsgrupper. Mange aminosyrer med sure eller basiske grupper anvendes i det aktive sted, f.eks. glutaminsyre og asparaginsyre, histidin, cystin, tyrosin, lysin og arginin samt serin og threonin. Desuden anvendes ofte peptidryggen med carbonyl- og amid-N-grupper. Cystin og histidin er meget almindeligt involveret, da de begge har en pKa tæt på neutral pH og derfor både kan acceptere og donere protoner.

Mange reaktionsmekanismer, der involverer syre/base-katalyse, forudsætter en væsentligt ændret pKa. Denne ændring af pKa er mulig gennem restens lokale miljø.

Betingelser	Syrer	Baser
Hydrofobt miljø	Forøgelse af pKa	Sænkning af pKa
Nærliggende rester med samme ladning	Forøgelse af pKa
pKa	Forringelse pKa
Saltbro- (og hydrogen bindings)dannelse	Forringelse pKa	Forringelse pKa

pKa kan også påvirkes betydeligt af det omgivende miljø, i det omfang, at rester, der er basiske i opløsning, kan fungere som protonedonorer og omvendt.

For eksempel:

Katalytisk triade af en serinprotease

Det indledende trin i serinproteasens katalytiske mekanisme indebærer, at histidinet på det aktive sted accepterer en proton fra serinresiduen. Dette forbereder serinen som en nukleofil til at angribe substratets amidbinding. Denne mekanisme omfatter donation af en proton fra serin (en base, pKa 14) til histidin (en syre, pKa 6), hvilket gøres muligt på grund af basernes lokale miljø.

Det er vigtigt at præcisere, at ændringen af pKa’erne er en ren del af den elektrostatiske mekanisme. Endvidere er den katalytiske effekt i ovenstående eksempel hovedsageligt forbundet med reduktionen af oxyanionens pKa og stigningen i histidinets pKa, mens protonoverførslen fra serin til histidin ikke katalyseres væsentligt, da den ikke er den hastighedsbestemmende barriere.

Elektrostatisk katalyseRediger

Stabilisering af ladede overgangstilstande kan også ske ved at rester i det aktive sted danner ioniske bindinger (eller delvise ioniske ladningsinteraktioner) med mellemproduktet. Disse bindinger kan enten komme fra sure eller basiske sidekæder, der findes på aminosyrer som f.eks. lysin, arginin, asparaginsyre eller glutaminsyre, eller komme fra metalcofaktorer som f.eks. zink. Metalioner er særligt effektive og kan reducere vands pKa nok til at gøre det til en effektiv nukleofil.

Systematiske computersimuleringsundersøgelser har vist, at elektrostatiske virkninger giver langt det største bidrag til katalysen. Det kan øge reaktionshastigheden med en faktor på op til 107. Det er især blevet konstateret, at enzym giver et miljø, der er mere polært end vand, og at de ioniske overgangstilstande stabiliseres af faste dipoler. Dette er meget forskelligt fra stabilisering af overgangstilstande i vand, hvor vandmolekylerne må betale med “reorganiseringsenergi”. For at stabilisere ioniske og ladede tilstande. Katalysen er således forbundet med, at enzymets polære grupper er præorganiserede

Størrelsen af det elektrostatiske felt, der udøves af et enzyms aktive sted, har vist sig at være stærkt korreleret med enzymets katalytiske hastighedsforøgelse

Binding af substrat udelukker normalt vand fra det aktive sted, hvorved den lokale dielektricitetskonstant sænkes til et organisk opløsningsmidlers dielektricitetskonstant. Dette styrker de elektrostatiske interaktioner mellem de ladede/polære substrater og de aktive steder. Desuden har undersøgelser vist, at ladningsfordelingerne omkring de aktive steder er arrangeret på en sådan måde, at de stabiliserer overgangstilstandene i de katalyserede reaktioner. I flere enzymer tjener disse ladningsfordelinger tilsyneladende til at lede polære substrater hen til deres bindingssteder, således at hastigheden af disse enzymatiske reaktioner er større end deres tilsyneladende diffusionskontrollerede grænser.

For eksempel:

Carboxypeptidase katalytiske mekanisme

Det tetraedriske mellemprodukt stabiliseres af en delvis ionisk binding mellem Zn2+-ionen og den negative ladning på ilten.

Kovalent katalyseRediger

Kovalent katalyse indebærer, at substratet danner en forbigående kovalent binding med rester i enzymets aktive sted eller med en cofaktor. Dette tilføjer et yderligere kovalent mellemprodukt til reaktionen og bidrager til at reducere energien i senere overgangstilstande i reaktionen. Den kovalente binding skal på et senere tidspunkt i reaktionen brydes for at regenerere enzymet. Denne mekanisme udnyttes af den katalytiske triade af enzymer som proteaser som f.eks. chymotrypsin og trypsin, hvor der dannes et acyl-enzymintermediat. En alternativ mekanisme er schiffbase-dannelse ved hjælp af den frie amin fra en lysinrest, som det ses i enzymet aldolase under glykolyse.

Enkelte enzymer udnytter ikke-aminosyrekofaktorer som f.eks. pyridoxalphosphat (PLP) eller thiaminpyrofosfat (TPP) til at danne kovalente mellemprodukter med reaktantmolekyler. Sådanne kovalente mellemprodukter fungerer til at reducere energien i senere overgangstilstande, på samme måde som kovalente mellemprodukter, der dannes med aminosyrerester på det aktive sted, giver mulighed for stabilisering, men kofaktorernes muligheder gør det muligt for enzymer at udføre reaktioner, som aminosyresideresterne alene ikke kunne udføre. Enzymer, der anvender sådanne cofaktorer, omfatter det PLP-afhængige enzym aspartattransaminase og det TPP-afhængige enzym pyruvatdehydrogenase.

Snarere end at sænke aktiveringsenergien for en reaktionsvej giver kovalent katalyse en alternativ vej for reaktionen (via det kovalente mellemprodukt) og adskiller sig således fra ægte katalyse. F.eks. bør energien i den kovalente binding til serinmolekylet i chymotrypsin sammenlignes med den velforståede kovalente binding til nukleofilen i den ikke-katalyserede opløsningsreaktion. Et ægte forslag om en kovalent katalyse (hvor barrieren er lavere end den tilsvarende barriere i opløsning) ville f.eks. kræve en delvis kovalent binding til overgangstilstanden af en enzymgruppe (f.eks. en meget stærk hydrogenbinding), og sådanne effekter bidrager ikke væsentligt til katalysen.

MetalionkatalyseRediger

En metalion i det aktive sted deltager i katalysen ved at koordinere ladningsstabilisering og afskærmning. På grund af et metals positive ladning kan kun negative ladninger stabiliseres gennem metalioner. Metalioner er imidlertid fordelagtige i biologisk katalyse, fordi de ikke påvirkes af ændringer i pH-værdien. Metalioner kan også virke ioniserende på vand ved at virke som en Lewis-syre. Metalioner kan også være agenter for oxidation og reduktion.

BindingsstramningRediger

Dette er den vigtigste effekt af induceret pasningsbinding, hvor enzymets affinitet til overgangstilstanden er større end til selve substratet. Dette inducerer strukturelle omlægninger, som spænder substratbindingerne ind i en position tættere på overgangstilstandens konformation, hvorved energiforskellen mellem substratet og overgangstilstanden sænkes og hjælper med at katalysere reaktionen.

Denne strain-effekt er imidlertid i virkeligheden en destabiliseringseffekt af grundtilstanden snarere end en stabiliseringseffekt af overgangstilstanden. Desuden er enzymer meget fleksible, og de kan ikke anvende stor strain-effekt.

Ud over bindingsstrækningen i substratet kan bindingsstrækningen også induceres i selve enzymet for at aktivere rester i det aktive sted.

For eksempel:

Substrat, bundet substrat og konformationer i overgangstilstand af lysozym.

Substratet, ved binding, forvrænges fra hexoseringens halve stolskonformation (på grund af den steriske hindring med aminosyrer i proteinet, der tvinger den equatoriale c6 til at være i aksial position) til stolskonformationen

KvantetunnelingRediger

Disse traditionelle “over the barrier”-mekanismer er i nogle tilfælde blevet udfordret af modeller og observationer af “through the barrier”-mekanismer (kvantetunneling). Nogle enzymer opererer med kinetik, der er hurtigere end det, der ville blive forudsagt af den klassiske ΔG‡. I “through the barrier”-modeller kan en proton eller en elektron tunnelere gennem aktiveringsbarrierer. Kvantetunnling for protoner er blevet observeret ved tryptaminoxidation ved aromatisk amindehydrogenase.

Kvantetunnling synes ikke at give en større katalytisk fordel, da tunneldannelsesbidragene er ens i de katalyserede og de ikke-katalyserede reaktioner i opløsning. Imidlertid er tunnelbidraget (der typisk øger hastighedskonstanterne med en faktor på ~1000 i forhold til reaktionshastigheden for den klassiske “over barrieren”-rute) sandsynligvis afgørende for biologiske organismers levedygtighed. Dette understreger den generelle betydning af tunnelreaktioner i biologien.

I 1971-1972 blev den første kvantemekaniske model for enzymkatalyse formuleret.

Aktivt enzymRediger

Bindingsenergien i enzym-substratkomplekset kan ikke betragtes som en ekstern energi, der er nødvendig for substrataktiveringen. Et enzym med et højt energiindhold kan først overføre en bestemt energigruppe X1 fra enzymets katalytiske sted til det endelige sted for den første bundne reaktant, hvorefter en anden gruppe X2 fra den anden bundne reaktant (eller fra den anden gruppe af den enkelte reaktant) skal overføres til det aktive sted for at afslutte substratomdannelsen til produkt og enzymgenoprettelsen.

Vi kan præsentere hele den enzymatiske reaktion som en to koblingsreaktioner:

S 1 + EX 1 ⟶ S 1 EX 1 ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {\ce {{S1}+ EX1 -> S1EX1 -> {P1}+ EP2}}}

(1)

S 2 + EP 2 ⟶ S 2 EP 2 ⟶ P 2 + EX 2 {\displaystyle {\ce {{S2}+ EP2 -> S2EP2 -> {P2}+ EX2}}}}

(2)

Det kan ses af reaktion (1), at gruppen X1 i det aktive enzym optræder i produktet på grund af muligheden for udvekslingsreaktion inde i enzymet for at undgå både elektrostatisk hæmning og repulsion af atomer. Så vi repræsenterer det aktive enzym som en kraftig reaktant i den enzymatiske reaktion. Reaktionen (2) viser en ufuldstændig omdannelse af substratet, fordi dets gruppe X2 forbliver i enzymet. Denne fremgangsmåde, som idéen tidligere havde foreslået, var baseret på hypotetiske ekstremt høje enzymatiske konverteringer (katalytisk perfekt enzym).

Det afgørende punkt for verificeringen af den nuværende fremgangsmåde er, at katalysatoren skal være et enzymkompleks med reaktionens overførselsgruppe. Dette kemiske aspekt understøttes af de velundersøgte mekanismer for de forskellige enzymatiske reaktioner. Tænk på reaktionen af peptidbindingshydrolyse, der katalyseres af et rent protein α-chymotrypsin (et enzym, der virker uden en cofaktor), som er et velundersøgt medlem af serinproteasefamilien, se.

Vi præsenterer de eksperimentelle resultater for denne reaktion som to kemiske trin:

S 1 + EH ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EH -> {P1}+ EP2}}}}

(3)

EP 2 + H – O – H ⟶ EH + P 2 {\displaystyle {\ce {{EP2}+ {H-O-H}-> {EH}+ P2}}}}

(4)

hvor S1 er et polypeptid, P1 og P2 er produkter. Det første kemiske trin (3) omfatter dannelsen af et kovalent acyl-enzym-mellemprodukt. Det andet trin (4) er deacyleringstrinnet. Det er vigtigt at bemærke, at gruppen H+, der oprindeligt findes på enzymet, men ikke i vand, optræder i produktet før hydrolysetrinet, og derfor kan den betragtes som en ekstra gruppe i den enzymatiske reaktion.

Dermed viser reaktionen (3), at enzymet fungerer som en kraftig reaktant i reaktionen. Ifølge det foreslåede koncept fremmer H-transporten fra enzymet den første reaktantomdannelse, nedbrydning af den første indledende kemiske binding (mellem grupperne P1 og P2). Hydrolysetrinet fører til nedbrydning af den anden kemiske binding og regenerering af enzymet.

Den foreslåede kemiske mekanisme er ikke afhængig af koncentrationen af substrater eller produkter i mediet. Et skift i deres koncentration forårsager dog hovedsagelig ændringer i den frie energi i de første og sidste trin af reaktionerne (1) og (2) på grund af ændringerne i det frie energiindhold af hvert molekyle, hvad enten det er S eller P, i vandopløsningen.Denne fremgangsmåde er i overensstemmelse med følgende mekanisme for muskelkontraktion. Det sidste trin i ATP-hydrolysen i skeletmuskulaturen er den produktfrigivelse, der skyldes myosinhovedernes associering med actin. Lukningen af den aktinbindende spalte under associationsreaktionen er strukturelt koblet med åbningen af den nukleotidbindende lomme på myosinets aktive sted.

Notatvis omfatter de sidste trin i ATP-hydrolysen den hurtige frigivelse af fosfat og den langsomme frigivelse af ADP.Frigivelsen af en fosfatanion fra bundet ADP-anion til vandopløsning kan betragtes som en exergonisk reaktion, fordi fosfatanionen har en lav molekylær masse.

Dermed når vi frem til den konklusion, at den primære frigivelse af det uorganiske fosfat H2PO4- fører til omdannelse af en betydelig del af den frie energi ved ATP-hydrolyse til den kinetiske energi af det solverede fosfat, hvilket producerer aktiv strømning. Denne antagelse om en lokal mekano-kemisk transduktion er i overensstemmelse med Tirosh’s mekanisme for muskelkontraktion, hvor muskelkraften stammer fra en integreret virkning af aktiv strømning skabt af ATP-hydrolyse.