Diagnose af Legionella-infektion

Legionellae kan isoleres fra en række forskellige prøvetyper, selv om sekreter fra de nedre luftveje (f.eks, sputum og bronkoskopiprøver) er de foretrukne prøver. Den største begrænsning ved sputumkultur er, at mindre end halvdelen af patienter med legionærsyge producerer sputum . Andre faktorer har indflydelse på kulturens følsomhed, når der er udtaget en sputumprøve. Legionellabakterier kan overleve dårligt i respiratoriske sekreter, og disse prøver bør behandles hurtigt. Nogle patienter med legionærsyge producerer sputum med relativt lidt purulens; disse prøver kan afvises af laboratorier, som kasserer sputumprøver, der indeholder få polymorphonukleære leukocytter . Der bør derfor ikke anvendes afvisningskriterier for sputumprøver, der sendes til legionellakultur. Laboratoriepersonalets erfaring er også vigtig, og laboratorier med erfaring med Legionella-kultur har større sandsynlighed for at genfinde organismen.

Den anslåede følsomhed af sputumkultur varierer fra <10% til ∼80% og varierer alt efter forskellige sammenligningsstandarder og de enkelte laboratorier . I praksis opnås de bedre resultater sandsynligvis kun af laboratorier med særlig interesse for Legionella-infektion, og følsomhederne er normalt <50%, når serologiske fund anvendes som standard. Bronkoskopiske prøver vil sandsynligvis give et større diagnostisk udbytte end ekspektorerede sputumprøver.

Legionella-arter kan isoleres fra blodkulturer, men udbyttet er ringe. Vækst af legionellae opretholdes af rutinemæssige blodkulturmedier, men aktiverer måske ikke alarmen i kommercielle blodkulturmaskiner . Derfor er det nødvendigt at foretage blinde subkulturer på faste medier. Samlet set er udbyttet af blodkulturer lavt og har sandsynligvis ingen indflydelse på den kliniske behandling.

Direct Fluorescent Antibody (Dfa)-farvning

DFA-farvning kan påvise legionellae i respiratoriske sekretioner og vævsprøver. Denne teknik har den fordel, at den giver et resultat inden for 2-4 timer, men den er teknisk krævende og bør udføres af erfarent laboratoriepersonale. Den rapporterede følsomhed af DFA-farvning varierer, er konsekvent mindre end kulturfarvning og er mindre præcist kendt for andre arter end L. pneumophila. For sekret fra de nedre luftveje ligger følsomheden generelt på 25-66 %, idet bronkoalveolær lavagevæskeprøver har et højere udbytte end enten transtracheale prøver eller sputumprøver . Specificiteten af DFA-farvning er blevet anslået til at være ∼94% , selv om testen sandsynligvis vil være mindre specifik i uerfarne hænder. Falsk-positive resultater kan forekomme på grund af krydsreaktioner med andre bakterier, herunder Bacteroides fragilis, Pseudomonas-arter, Stenotrophomonas-arter og Flavobacterium-arter. Krydsreaktioner kan være et mindre problem, når der anvendes monoklonale antistof-DFA-midler. Problemer med følsomhed og specificitet har begrænset brugen af DFA-farvning, og et positivt DFA-resultat i mangel af andre understøttende beviser accepteres nu generelt ikke som tilstrækkeligt til at stille diagnosen Legionella-infektion.

Urinær antigenbestemmelse

Detektion af opløseligt Legionella-antigen i urinprøver er en hurtig metode, der giver en tidlig diagnose af Legionella-infektion og har været et nyttigt redskab til undersøgelse af udbrud af legionærsyge . Kommercielle kits, der anvender både RIA- og EIA-metodologier, har været tilgængelige i flere år og har lignende præstationsegenskaber. For nylig er der blevet udviklet et immunokromatografisk assay (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax), som har samme følsomhed og specificitet som EIA . Denne test er let at udføre og kan give et resultat inden for 15 minutter.

Med hensyn til påvisning af L. pneumophila serogruppe 1 har urinantigen-testene en følsomhed på 70-100 % og en specificitet på næsten 100 % . Sensitiviteten kan øges med op til 20 % ved at koncentrere urinprøverne 25 gange før testning . Den største ulempe ved disse test er deres manglende evne til pålideligt at påvise andre organismer end L. pneumophila serogruppe 1. Der er blevet udviklet bredspektretest, som påviser opløselige antigener fra en lang række Legionella-arter, men de er ikke kommercielt tilgængelige. Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) er beregnet til at påvise andre legionellae end L. pneumophila serogruppe 1, men den er mindre pålidelig, end den er til at påvise L. pneumophila serogruppe 1 . Der er forekommet falsk-positive urinantigenresultater hos patienter med serumsyge .

Legionella-antigenuri kan påvises allerede 1 dag efter symptomdebut og fortsætter i dage til uger. I et tilfælde blev der dokumenteret udskillelse af antigen i >300 dage . Opløselige Legionella-antigener er også blevet påvist i andre prøver end urin, herunder prøver af sputum, lungevæv, serum og pleuravæske, selv om brugen af sådanne prøver ikke er blevet fuldt evalueret.

Urinær antigenundersøgelse er nu et etableret og værdifuldt redskab til diagnosticering af legionærsyge, især i regioner, hvor L. pneumophila serogruppe 1 er den mest almindelige årsag til sygdommen. På steder, hvor kun et mindretal af infektionerne er forårsaget af L. pneumophila serogruppe 1, bidrager de nuværende urinantigenanalyser i mindre grad til de eksisterende laboratorieundersøgelser.

Serologisk testning

Serologisk testning for Legionella-infektion er et værdifuldt epidemiologisk redskab, men har kun ringe indflydelse på den kliniske beslutningstagning på grund af den tid, der går, før et resultat er tilgængeligt. De antistoffer, der produceres som reaktion på infektion, er generelt en blanding af IgA, IgM og IgG, og testene bør påvise alle typer for at opnå optimal følsomhed. Måling af specifikt IgM er en upålidelig markør for akut infektion, fordi IgM-antistoffer kan persistere i lange perioder. Serokonversion kan tage flere uger, hvilket er en væsentlig begrænsning ved serologisk testning. I de fleste tilfælde påvises en 4-dobbelt stigning i antistoftiteren inden for 3-4 uger, men i nogle tilfælde kan det tage >10 uger . Hvis der tages serumprøver i rekonvalescensfasen for tidligt, resulterer det utvivlsomt i mange falsk negative resultater, og det er sandsynligvis en del af forklaringen på de 20-30 % af patienterne med legionærsyge, som angiveligt ikke udvikler et påviseligt antistofrespons . Det er imidlertid klart, at en del af personer med påvist legionellainfektion ikke har påviselig serokonversion . I praksis bør klinikere tilskyndes til at udtage serumprøver i rekonvalescensfasen 3 uger efter sygdomsudbruddet med henblik på testning parallelt med serumprøver, der er udtaget i den akutte fase. Hvis der ikke er nogen serokonversion efter dette tidsrum, og der stadig er mistanke om Legionella-infektion, bør der udtages en yderligere prøve i rekonvalescensfasen.

Af de forskellige antistofdetektionsmetoder, der er til rådighed, er indirekte immunofluorescens den standardreferenceprøve. En 4-dobbelt eller større stigning i den reciprokke antistoftiter til ⩾128 betragtes som diagnostisk. Akutfasens reciprokke antistoftiter på ⩾256 i tilstedeværelse af lungebetændelse blev tidligere anset for at være tilstrækkelig til en formodet diagnose, men dette har vist sig at være upålideligt, især i betragtning af den høje prævalens af Legionella-antistofpositivitet hos nogle personer uden kliniske tegn på legionellose. Der er stort set ingen rolle for testning af enkelte serumprøver.

En anden ulempe ved serologisk testning er den manglende evne til nøjagtigt at påvise alle Legionella-arter og serogrupper. Selv om serokonversion til L. pneumophila serogruppe 1 generelt anses for at være stærkt sygdomsforudsigende, er følsomheden og specificiteten af serokonversion til andre arter og serogrupper ikke blevet strengt bekræftet. Desuden kan dannelse af krydsreaktive antistoffer blandt medlemmer af Legionellaceae-familien gøre det vanskeligt at fastslå den inficerende art eller serogruppe. Nogle patienter med ikke-L. pneumophila serogruppe 1-infektion vil få serokonversion til L. pneumophila serogruppe 1 . Omvendt tyder sekvensbaseret identifikation af Legionella-PCR-produkter fra patienter, der har haft serokonversion til andre Legionella-arter end L. pneumophila, på, at nogle af dem sandsynligvis har været inficeret med L. pneumophila (upublicerede observationer). Der findes også lejlighedsvis krydsreaktive antistoffer hos patienter med infektioner forårsaget af ikke-Legionella-bakterier, herunder pseudomonader, mykobakterier, Bacteroides-arter og Campylobacter-arter. Der forekommer en interessant krydsreaktion mellem L. bozemanii og Rickettsia typhi som følge af et fælles antigen.

Nukleinsyreforstærkning

Den seneste tid har DNA-detektionsteknikker vist sig lovende til hurtig diagnosticering af Legionella-infektion. PCR muliggør specifik amplifikation af meget små mængder Legionella-DNA, giver resultater inden for en kort tidsramme og har potentiale til at påvise infektioner forårsaget af alle Legionella-arter og serogrupper. På nuværende tidspunkt er Legionella-PCR kun tilgængelig i et begrænset antal laboratorier, der anvender en række interne assays.

PCR er med succes blevet anvendt til påvisning af Legionella-DNA i en række miljøprøver og kliniske prøver. Ved undersøgelse af prøver fra de nedre luftveje har PCR gentagne gange vist sig at have en følsomhed, der er lig med eller større end kultur . PCR kan således betragtes som den foretrukne test for patienter, der producerer sputum. PCR’s rolle i forbindelse med testning af andre prøvetyper er mindre klar. Legionella-DNA kan påvises i urin-, serum- og leukocytprøver fra patienter med legionærsyge med en sensitivitet på 30-86 % . Det er sandsynligt, at PCR’s følsomhed øges, når man tester prøver, der er udtaget tidligt i sygdomsforløbet, og når man tester >1 prøvetype fra hver patient . Svaberprøver fra halsen kan også være en egnet prøve til PCR-testning, men denne anvendelse er kun blevet evalueret i en enkelt undersøgelse.

Der er behov for yderligere arbejde for at etablere en standard PCR-metode, der er robust nok til at kunne anvendes uden for et forskningslaboratorium. Anvendelsen på ikke-respiratoriske prøver er særlig attraktiv, fordi dette vil omgå problemet med patienter, der ikke producerer sputumprøver. Udviklingen af en optimal PCR-analyse er blevet vanskeliggjort af den periodiske kontaminering af nogle kommercielle DNA-ekstraktionskits med Legionella-DNA . Anvendelse af disse kits til behandling af prøver kan resultere i falsk-positive resultater og understreger vigtigheden af at inkludere passende kontroller i hver testkørsel.

Teststrategi

Da legionærsyge ikke kan adskilles klinisk eller radiografisk fra andre årsager til lungebetændelse, kan beslutningen om at teste for Legionella-infektion være vanskelig og træffes ofte på uregelmæssig vis. Det er vigtigt at være bekendt med den lokale epidemiologi. Nogle laboratorier i områder, hvor Legionella-arter er en almindelig årsag til lungebetændelse, har valgt rutinemæssigt at dyrke alle sputumprøver fra patienter med lungebetændelse på Legionella-medier. Kun få laboratorier vil dog være i stand til at retfærdiggøre de ekstra omkostninger, der er forbundet med rutinemæssig legionellakultur. De fleste steder er forekomsten af Legionella-infektion ukendt, og beslutningen om at bestille diagnostiske test for Legionella-infektion er normalt begrænset til risikopatienter, til patienter med alvorlig lungebetændelse og til udbrudsscenarier. Det er bestemt muligt at udvælge en delmængde af patienter, for hvilke udbyttet af Legionella-diagnostiske test sandsynligvis vil være relativt højt. Denne gruppe omfatter ældre personer, rygere, immunsupprimerede personer, personer med kroniske lungesygdomme, patienter, der bor på hospitaler med Legionella-koloniseret vandforsyning, og personer, der er udsat for potteblanding. Forekomsten af legionærsyge er højere blandt patienter med alvorlig lungebetændelse, og alle patienter med lungebetændelse, der indlægges på en intensivafdeling, bør testes for denne infektion.

På steder, hvor L. pneumophila serogruppe 1 er den fremherskende årsag til Legionella-infektion, eller under et udbrud af infektion med L. pneumophila serogruppe 1, er urinantigen-testen et særligt værdifuldt diagnostisk værktøj. Udviklingen af en kommerciel urinantigen-test, der også på pålidelig vis påviser andre humane Legionella-patogener, ville være et stort fremskridt og ville sandsynligvis gøre denne test til den foretrukne diagnostiske test i næsten alle situationer. På geografiske steder, hvor andre legionellae end L. pneumophila serogruppe 1 er numerisk vigtige patogener, er de nuværende urinantigen-tests stadig nyttige, men bør ikke anvendes som det eneste diagnostiske værktøj. Hvis den er tilgængelig, er Legionella PCR kombineret med urinantigenprøver sandsynligvis den bedste indledende teststrategi, der kan påvise alle Legionella-arter og give resultater inden for en tidsramme, der kan påvirke den kliniske behandling.

Hvis PCR ikke er tilgængelig, er urinantigenprøver kombineret med dyrkning af prøver fra de nedre luftveje den bedste testkombination. Kultur er fortsat et vigtigt diagnostisk værktøj, men dens relativt lave følsomhed og afhængigheden af tilgængeligheden af en prøve fra de nedre luftveje gør den utilstrækkelig som eneste diagnostiske test. Selv om serologisk testning ikke har nogen indflydelse på den indledende behandling, kan den være nyttig, hvis der ikke stilles en specifik diagnose i den akutte fase af infektionen, men både prøver fra den akutte fase og prøver fra den rekonvalescerende fase skal testes parallelt. Under et formodet udbrud af legionærsyge er en aggressiv tilgang til diagnosen berettiget, hvilket vil indebære anvendelse af en kombination af testmetoder.

Legionella-arter kan lejlighedsvis forårsage Pontiac-feber, en akut, febril, ikke-pneumonisk sygdom, der er kendetegnet ved en høj angrebsrate, kort inkubationstid og hurtig bedring. Diagnosen af Pontiac-feber er normalt baseret på genkendelse af typiske kliniske træk i en udbrudssituation, og diagnosen bekræftes ved serologisk testning af de berørte personer. Brugen af kultur er stort set begrænset til at teste miljøprøver for at bestemme kilden til udbruddet, selv om L. pneumophila serogruppe 1 er blevet isoleret fra et trachealaspirat fra et barn med Pontiac-feber .

Konklusioner

Legionella-infektion er utvivlsomt underkendt. Diagnosen er afhængig af anvendelsen af specialiserede test, ofte i kombination. Urinantigenprøver, sputumkultur og PCR-test af prøver fra de nedre luftveje er de vigtigste diagnostiske værktøjer til påvisning af Legionella-infektion tidligt i sygdomsforløbet. Udviklingen af urinantigen-testassays, der påviser et bredere spektrum af patogene legionellae, og udviklingen af standardiserede PCR-assays vil være et stort fremskridt inden for Legionella-diagnostik. Den øgede tilgængelighed og anvendelse af forbedrede diagnostiske test vil bidrage til bedre at karakterisere epidemiologien af legionærsyge, herunder den reelle forekomst og den geografiske variation.

Akkordserklæringer

Jeg er Steve Chambers taknemmelig for nyttige kommentarer til artiklen i manuskriptet.