Snížení virulence
Je také nezbytné vyvinout bakterie tak, aby se minimalizovala jejich virulence vůči imunitnímu systému hostitele46,47. Je třeba poznamenat, že některé faktory bakteriální virulence mohou být zodpovědné za jejich vlastní protinádorovou aktivitu. Proto je třeba dosáhnout útlumu, aniž by došlo k ablaci jejich protinádorové aktivity. Například u lidských patogenů byly smrtelně toxické kmeny přeměněny na převážně bezpečné kmeny prostřednictvím delece hlavních genů virulence2,10,21. VNP20009, oslabený kmen S. Typhimurium, byl vytvořen delecí genů msbB a purI; tento kmen byl rozsáhle studován na myších s nádory a vykazuje slibnou nádorovou specifitu a nádorové inhibiční účinky28,48,49,50 . Delece msbB u rodu Salmonella vede k myristoylaci lipidové složky A LPS, což má za následek významné snížení indukce TNF vyvolané LPS a může snížit riziko septického šoku51. VNP20009 byl následně testován ve studiích fáze I u lidských pacientů s rakovinou51,52,53,54. Zklamáním bylo, že VNP20009 postrádal nádorovou specifitu a neměl jasnou hodnotu v léčbě nádorů u těchto pacientů52,54,55. Tento neúspěch lze přičíst penta-acylovanému lipidu A produkovanému VNP20009, který je antagonistou TLR456. K modifikaci struktury LPS za účelem udržení protinádorové aktivity byly pomocí delece genů pagP, pagL a lpxR47,57,58 vytvořeny mutantní kmeny salmonel, které produkují homologní hexa-acylovaný lipid A, který má vysokou afinitu k TLR4. Tyto mutace neměly vliv na virulenci na pozadí mutantů msbB59. Mutace v rfaG a rfaD vedou k produkci zkráceného LPS, což má za následek oslabení toxicity a nádorové specifity; protinádorové účinky těchto bakterií však byly také sníženy. Chromozomální integrace genů pro biosyntézu LPS do lokusu araBAD tato omezení překonala a mutantní kmen vykazoval oslabenou virulenci a terapeutické účinky60.
Další netoxický kmen salmonel byl vytvořen snížením exprese genů spojených s endotoxinem nebo inhibicí jejich funkční aktivity. Salmonella relA- a spoT-mutantní kmeny defektní v syntéze ppGpp, signální molekuly zapojené do exprese toxinových genů, vykazovaly zanedbatelnou toxicitu. Hodnota LD50 kmene ΔppGpp byla ve srovnání s kmeny divokého typu zvýšena až 105-106krát61. Kmen ΔppGpp měl vynikající protinádorovou aktivitu prostřednictvím své schopnosti aktivovat inflammasom (NLRP3, IPAF) a indukovat expresi několika prozánětlivých cytokinů (IL-1β, IL-18 a TNF-α)21 . Delece genů phoP a phoQ neovlivnila protinádorovou aktivitu salmonely, zatímco delece snížily její virulenci v normální tkáni62. Kmeny nesoucí tyto mutace byly použity k výrobě vynikající vakcíny a v poslední době se používají jako nosič nádorových terapeutik63,64,65,66,67. Perorální podání mutantního kmene S. Typhimurium s nedostatkem syntézy transportního systému zinku ZnuABC může vyvolat účinnou imunitní odpověď, která chrání myši před střevními infekcemi68. Mutace genů kódujících DNA adeninmetylázu, adenylátcyklázu a protein receptoru cyklického adenosinmonofosfátu, které jsou zapojeny do různých cest regulace patogenních genů, by mohly snížit bakteriální toxicitu in vivo69. Delece genu gmd u salmonel inhibovala tvorbu biofilmu a vyvolala imunitní odpověď v časné fázi infekce28,57. Kromě toho delece genů htrA, STM3120 a slyA významně snížila přežívání bakterií v makrofázích i jejich protinádorové účinky70. Delece genů zapojených do buněčné invaze může oslabit cytotoxicitu Listeria monocytogenes. Delece Hly způsobuje defekty v uvolňování fagolysosomů52,71,72. Mutantní kmeny L. monocytogenes postrádající actA nebo ActA sekvence podobné PEST také postrádají schopnost mezibuněčné difúze73,74 a mutantní kmeny postrádající inlA a inlB jsou defektní v invazi75,76.
Vedení specifických mutací závislých na živinách u bakterií je dalším přístupem ke zlepšení nádorově specifické proliferace s útlumem virulence. Kmen A1-R salmonel, který je auxotrofní pro leucin a arginin, přednostně kolonizuje nádory, vykazuje protinádorové účinky a zvyšuje citlivost nádorů k chemoterapii22,77,78,79. V případě kmene A1-R se jedná o kmen, který je auxotrofní pro leucin a arginin. Kmen L. monocytogenes byl upraven tak, aby byl auxotrofní pro složku buněčné stěny d-alanin prostřednictvím inaktivace lokusu dal/dat. Tento mutantní kmen byl vysoce oslabený a mohl indukovat cytotoxické T lymfocyty22,80. Kmeny salmonel SL3261 a SL7207, které nesou deleci aroA, a BRD509, což je kmen s dvojitou mutací aroA/aroD, který je auxotrofní pro aromatické aminokyseliny, jsou vysoce oslabené a v hostiteli se volně nerozptylují29,57,81,82,83,84,85 . Jiný kmen S. Typhimurium, YB1, který byl odvozen od SL7207 umístěním esenciálního genu asd pod kontrolu hypoxií indukovaného promotoru, nemohl přežít v normální tkáni bez exogenního přísunu kyseliny diaminopimelové, ačkoli stále mohl kolonizovat hypoxické nádory; tento kmen tedy způsobuje snížené poškození normální tkáně a zároveň si zachovává schopnost cílit na nádory21,47,86,87. Kromě toho delece genů purI a purD vedla k potřebě exogenního adeninu, což zvýšilo schopnost bakterií účinně se množit v oblastech bohatých na purin, jako je například nádorová tkáň2,88 . Atenuované bakteriální kmeny používané pro terapii rakoviny jsou uvedeny v tabulce 1.
Zlepšení cílení na nádor
Inženýrské přístupy používané ke zlepšení cílení bakterií na nádor mohou také zvýšit bezpečnost i protinádorovou účinnost. V rámci jednoho přístupu k dosažení těchto výsledků byl kmen SHJ2037 s deficitem ppGpp geneticky upraven tak, aby na povrchu buněk zobrazoval nádorově specifické ligandy. Arg-Gly-Asp peptid, který se váže na αvβ3 integrin, byl fúzován s vnějším membránovým proteinem A, aby došlo k jeho expresi na povrchu bakterie89. Výsledný kmen vykazoval zvýšenou nádorovou specifitu a výrazně zvýšenou protinádorovou aktivitu u buněk karcinomu prsu MDA-MB-231 a xenograftu melanomu MDA-MB-435 s nadměrnou expresí αvβ3 integrinu. Bakterie byly také upraveny tak, aby cílily na antigeny spojené s nádorem, jako je karcinoembryonální antigen nebo antigen CD20 spojený s lymfomy. Tyto kmeny měly účinné protinádorové účinky a snížily nespecifickou akumulaci bakterií v játrech a slezině90,91. Využitím vazby biotinu a treptavidinu byl zkonstruován kmen L. monocytogenes, u něhož byly buňky potaženy nanočásticemi s plasmidem, které exprimovaly gen pro bioluminiscenci. Tento kmen, nazývaný mikrorobot, dodával funkční molekuly nukleových kyselin do solidních nádorů a mohl být sledován pomocí bioluminiscenčního zobrazování60,92,93. Zajímavou alternativou, která může zvýšit selektivitu nádorů, je zobrazení syntetických adhezinů (SA) na povrchu E. coli. SA mají modulární strukturu sestávající ze stabilní β-domény potřebné pro ukotvení ve vnější membráně a povrchově exponovaných imunoglobulinových domén s vysokou afinitou a specifitou, které lze vybírat z velkých knihoven94. Probiotické kmeny vykazovaly zlepšenou nádorovou specifitu zvýšením injekční kapacity bakterií bez oslabení jejich vnitřních vlastností95,96,97,98,99. Probiotické buňky E. coli Symbioflor-2 byly velmi rychle odstraněny ze sleziny a jater a přežívaly pouze v nádoru, což svědčí o účinném cílení na nádor. Myši infikované probiotickým kmenem Salmonella snášely velkou bakteriální zátěž bez jakýchkoli patologických příznaků; je však třeba zlepšit systém dodávání užitečného zatížení vzhledem k nižší terapeutické účinnosti tohoto kmene, a to navzdory jeho vynikající bezpečnosti in vivo57.
Strategie exprese léčiv
Většina užitečných zatížení dodávaných bakteriemi cílenými na nádory je toxická jak pro nádorové, tak pro normální buňky; proto se upřednostňuje přísná kontrola jejich produkce před konstitutivní expresí. Přesné spuštění exprese užitečného zatížení může maximalizovat jeho terapeutické účinky a zároveň minimalizovat systémovou toxicitu. Systém řízené genové exprese lze teoreticky zkonstruovat vložením specifické promotorové sekvence před gen kódující léčivo, čímž se zajistí řízení transkripce prostřednictvím vnějších signálů. Takový systém umožňuje řídit načasování a umístění produkce léčiva in vivo. Strategie pro tento typ genové regulace neboli spouštění patří většinou do těchto tří kategorií: vnitřní spouštění, samospouštění (quorum sensing-QS) a vnější spouštění100.
Na rozdíl od normální tkáně mají TME zvláštní vlastnosti, včetně hypoxie, acidózy a nekrózy, které mohou bakterie vycítit a využít ke zlepšení nádorové specifity101. Například hypoxií indukovatelné promotory, jako jsou promotory HIP-1 a pepT, jsou aktivovány redukcí fumarátu a dusičnanů v hypoxickém prostředí v nádorové tkáni102,103,104 . Tento hypoxií indukovaný expresní systém byl navržen tak, aby fungoval pouze za anaerobních podmínek pro expresi základních genů, jako je asd105. Flentie a spol. identifikovali pět promotorových sekvencí specificky aktivovaných kyselým mikroprostředím spojeným s nádorovými buňkami in vitro a s nádory in vivo. Promotory specifické pro acidózu byly identifikovány pomocí speciálně navrženého bezpromotorového transpozonového reportéru kódujícího bakteriální luciferázu ke screeningu knihovny 7400 nezávislých mutantů transpozonové inserce salmonel v kokultuře s buňkami melanomu nebo karcinomu tlustého střeva. Oslabený kmen Salmonella exprimující Shiga toxin pod kontrolou promotoru indukovaného nízkým pH vykazoval silnou nádorovou selektivitu a protinádorovou aktivitu106. V E. coli byl syntetickou fúzí chemoreceptoru Trg s osmosenzorem EnvZ vytvořen glukózový senzor. V tomto konstruktu Trg přispívá periplazmatickou a transmembránovou doménou a krátkým cytoplazmatickým segmentem a EnvZ přispívá cytoplazmatickou kinázovou/fosfatázovou doménou. Upravené bakterie snímaly hladinu glukózy v nádorových buňkách a reagovaly na metabolickou aktivitu nádoru, což pravděpodobně vedlo k jejich terapeutickému účinku. Tyto vlastnosti jsou pravděpodobně zachovány i u dalších členů této senzorové rodiny107.
Bakterie mohou kolonizovat a množit se v TME v poměru nádor/normální tkáň přesahujícím 10 000; QS lze tedy použít jako přepínač genové exprese108,109. Jeden užitečný systém QS je regulován autoinduktorem, syntetickým proteinem LuxI, a transkripčním regulačním proteinem LuxR. Acylhomoserin lakton (AHL) produkovaný LuxI, který závisí na hustotě bakterií, aktivuje LuxR a podporuje transkripci cílových genů. Systémy QS závislé na koncentraci AHL byly úspěšně použity k vysoké expresi heterologních proteinů v nádorech kolonizovaných bakteriemi90,109,110,111. Přístup QS byl použit k zavedení různých genových okruhů. Například zavedení synchronizovaného lyzujícího okruhu do bakterií zlepšilo protinádorovou účinnost tím, že umožnilo uvolňování léčiva prostřednictvím periodického zavádění autoinduktoru (pozitivní zpětná vazba) a následné aktivace lyzujícího genu bakteriofága (negativní zpětná vazba)108.
Kromě vnitřního a samospouštěcího systému lze expresi genových okruhů řídit také vnějšími induktory, včetně chemických látek, jako je l-arabinosa, kyselina salicylová (ASA) a tetracyklin. Transkripce z promotoru PBAD může být řízena prostřednictvím interakce mezi represorem AraC a l-arabinózou5,112. U oslabeného kmene salmonel lze expresi terapeutické zátěže z plazmidu řízenou pBAD regulovat intravenózním nebo intraperitoneálním podáním l-arabinózy20,21,113 . Kmen salmonel s mutací v operonu Ara, která vede k poruše metabolismu l-arabinózy, vykazuje silnou aktivaci promotoru PBAD114. V expresním systému ASA je genová regulace řízena promotorem Pm závislým na XylS2115,116,117. Oslabený kmen Salmonella nesoucí expresní systém ASA na plazmidu nebo na chromozomu umožnil účinnou regulaci genů kódujících enzymy konvertující proléčiva (viz níže) a vedl k výraznému snížení růstu nádorů115. Expresní systém pTet je současně regulován obousměrnými promotory PtetA a PtetR, které jsou indukovány tetracyklinem nebo doxycyklinem118. V preklinické studii byl pod tyto obousměrné promotory vložen reportérový gen a terapeutický gen za účelem vizualizace procesu cílení, respektive doručení terapeutických léčiv7. Tento chemicky indukovatelný systém je regulován v závislosti na dávce a čase119 , proto nepřesnosti v načasování podání induktoru nebo v dávce induktoru mohou vést k nespecifické nebo suboptimální expresi cílových molekul v TME. Alternativní indukovatelný systém využívá radiačně indukovatelný promotor recA48. Radiace způsobuje poškození DNA, které aktivuje transkripci genů pod kontrolou promotoru recA. Tato metoda kombinuje terapeutické účinky radioterapie s radiačně závislou indukcí exprese protinádorových genů120. Indukce exprese ligandu TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) prostřednictvím dávky 2 Gy γ-záření 48 hodin po podání upraveného kmene Salmonella významně zpomalila růst buněk rakoviny prsu 4T148. Ozařování je výhodné, protože může proniknout do nádorové tkáně a být použito k lokalizované léčbě. Záření však může také způsobit toxicitu tím, že vyvolá poškození DNA ve zdravých buňkách v okolí nádoru a pravděpodobně způsobí fatální mutace v terapeutických bakteriích, které by mohly oslabit jejich terapeutický účinek101.
Dodání léků
Přes studie o protinádorových účincích bakterií samotné bakterie často nestačí k úplnému potlačení nádorů. Pro zvýšení pozitivních výsledků bakteriální terapie rakoviny byla zkoumána užitečnost eukaryotických a prokaryotických expresních systémů pro dodávku terapeutického užitečného zatížení, včetně cytotoxických látek, enzymů konvertujících proléčiva, imunitních regulátorů, molekul cílených na nádorové stroma a siRNA (uvedených v tabulce 2). Výše uvedené prokaryotické expresní systémy jsou nejčastěji používaným přístupem a tyto systémy závisí na transformaci bakterií prokaryotickými plazmidy kódujícími cílové geny70,121,122; naproti tomu eukaryotické expresní systémy zahrnují transdukci hostitelských buněk, jako jsou imunitní nebo nádorové buňky, eukaryotickými plazmidy kódujícími cDNA cílových genů123.
Cytotoxické látky
Cytotoxické látky nesené bakteriemi zaměřenými na nádory mohou mít vlastní protinádorovou aktivitu. V kombinaci s použitím indukovatelných promotorů lze expresi cytotoxických látek přísně kontrolovat a snížit tak jejich toxické účinky na normální tkáň. Cytolysin A (ClyA), 34 kDa hemolytický protein tvořící póry, produkovaný bakteriemi E. coli, S. Typhimurium a Paratyphi A, může být transportován na povrch bakterie a vylučován bez posttranslační modifikace. Několik bakteriálních kmenů, například E. coli a oslabené S. Typhimurium, bylo upraveno tak, aby exprimovaly ClyA z konstitutivního promotoru5 nebo z indukovatelných promotorů aktivovaných arabinózou5 nebo doxycyklinem7, a tyto kmeny vykazovaly vynikající nádorové inhibiční účinky.
Indukce apoptózy v nádorových buňkách je slibnou strategií léčby rakoviny. Apoptin, protein odvozený od viru kuřecí anémie, selektivně indukuje apoptózu u velkého počtu typů lidských nádorových buněk cestou nezávislou na p53 a necitlivou na Bcl-2, bez účinků na normální tkáň124. Transformací eukaryotického expresního plasmidu kódujícího apoptin (pCDNA3.1) do oslabeného kmene S. Typhimurium pozorovali Wen et al. významnou regresi nádoru s minimální systémovou toxicitou u myší s lidskou rakovinou hrtanu65. Mezi další cytotoxické látky, které lze podobně použít k vyvolání apoptózy, patří tři členové rodiny TNF-α (TNF-α, TRAIL a ligand Fas); vzhledem k jejich krátkému poločasu rozpadu a hepatotoxicitě je však užitečnost těchto cytotoxických ligandů omezena jejich nedostatečnou expozicí nádoru a škodlivými účinky na funkci jater125. Pro zlepšení biologické dostupnosti a udržitelnosti těchto proteinů byly použity bakterie, které je dodávají přímo do oblasti nádoru48,78,126,127. Forbes a spol. vytvořili nepatogenní kmen S. Typhimurium exprimující myší TRAIL pod kontrolou radiačně indukovatelného promotoru recA. Po ozáření byl TRAIL vylučován, načež významně zpomalil růst nádoru mléčné žlázy a snížil riziko úmrtí48.
Invasin, povrchový protein Yersinie, se může selektivně vázat na β1 integrin a vyvolat tak vstup bakterie do hostitelských buněk. S použitím nepatogenního rekombinantního invazivního kmene E. coli, který koexprimuje invasin a modelový antigen ovalbumin i LLO, Critchley-Thorne a spol. prokázali, že upravený kmen může invadovat do buněk exprimujících β1 integrin a dodávat proteiny do nádorů, aby vyvolal terapeutické účinky u myší128. Azurin, nízkomolekulární redoxní protein, může být účinně internalizován, aby inicioval apoptózu nádorových buněk zvýšením intracelulární hladiny p53 a Bax a vyvolal tak uvolnění mitochondriálního cytochromu c do cytosolu. Účinnost podávání azurinu na bázi E. coli při potlačování růstu myšího melanomu B16 a myšího karcinomu prsu 4T1 prokázal Nissle v roce 1917; tento přístup navíc také zabránil vzniku plicních metastáz a stimuloval zánětlivé reakce29.
Enzymy konvertující proléčiva
Exprese enzymů konvertujících proléčiva může přeměnit proléčiva na cytotoxické látky specificky v oblasti nádoru. Byla zkoumána užitečnost této strategie pro zlepšení účinnosti léčby rakoviny a snížení vedlejších účinků spojených se systémovým podáváním. Několik enzymů konvertujících proléčiva bylo dodáno bakteriemi96,129,130,131. Cytosin deamináza (CD) přeměňuje netoxický 5-fluorocytosin (5-FC) na chemoterapeutikum 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU je vysoce toxický, protože je dále metabolizován na produkt, který narušuje syntézu DNA a RNA132,133,134,135. Po současném podání oslabeného kmene S. Typhimurium (VNP20009) exprimujícího E. coli CD a 5-FC pacientům byla pozorována přeměna 5-FC na 5-FU, což ukazuje na bakteriální produkci funkčního CD v nádoru54.
Systém thymidinkináza/ganciklovir (HSV1-TK/GCV) viru herpes simplex typu I je další kombinací proléčiv konvertující enzym/proléčivo, která byla široce studována pro použití v terapii nádorů. Exprese HSV1-TK specifická pro nádorovou tkáň může přeměnit netoxický prekurzor ganciklovir na ganciklovir-3-fosfát, toxickou látku, která zabíjí nádorové buňky. Liu a spol. testovali in vivo účinnost kmene Bifidobacterium infantis exprimujícího HSV1-TK a GCV pro proléčebnou terapii na modelu nádoru močového měchýře u potkanů. Výsledky ukázaly, že tento cílený přístup může účinně inhibovat růst nádoru močového měchýře potkanů zvýšením exprese kaspázy 3 a vyvoláním apoptózy131. Další kmen dodávající enzym konvertující proléčivo, E. coli DH5α exprimující β-glukuronidázu, která hydrolyzuje glukuronidové proléčivo 9ACG na inhibitor topoizomerázy I 9-aminokamptothecin (9AC), prokázal účinnou inhibici nádoru129. Použití oslabeného S. Typhimurium VNP20009 jako vektoru pro dodání karboxypeptidázy G2 ukázalo zvýšenou protinádorovou účinnost ve spojení s podáním proléčiva130.
Imunomodulátory
Cytokiny mohou dosáhnout protinádorových účinků usnadněním proliferace, aktivace a diferenciace imunitních buněk, vyvoláním apoptózy v nádorových buňkách a prostřednictvím antiangiogenetických účinků na nádorové cévy. Několik cytokinů, včetně GM-CSF, IL-12 a IL-18, vstoupilo do klinických studií pro léčbu rakoviny136. Cytokiny exprimované bakteriemi cílenými na nádor byly dodávány specificky do oblasti nádoru, kde zvyšovaly protinádorovou imunitní odpověď v TME20,29,49,62,137,138,139,140. Intravenózní podání oslabeného kmene S. Typhimurium exprimujícího IL-18 inhibovalo růst primárního nádoru u myší, vyvolalo masivní infiltraci leukocyty (hlavně granulocyty) a zvýšilo nábor NK a CD4+ T-buněk, nikoli však CD8+ T-buněk. Kromě toho tento přístup také zvýšil produkci cytokinů v oblasti nádoru, včetně IL-1β, TNF-α, IFN-γ a GM-CSF49. IL-2 je nejčastěji studovaným cytokinem v souvislosti s bakteriálními doručovacími systémy. Perorální podávání kmene S. Typhimurium Ty21a exprimujícího IL-2 inhibovalo hepatocelulární karcinom (HCC) na myších modelech23,29 . Flagellin, který aktivuje vrozený imunitní systém prostřednictvím TLR5, byl zaveden jako vynikající imunoterapeutické adjuvans141. Naše skupina léčila myši s rakovinou tlustého střeva oslabeným ΔppGpp kmenem S. Typhimurium exprimujícím heterologní flagellin a prokázala, že zvyšuje protinádorovou imunitu prostřednictvím spolupráce se signálními drahami TLR4 a TLR5. Tento přístup také podporuje posun M2 do M1 u makrofágů a zvyšuje hladiny oxidu dusnatého v nádorech20.
Inženýrské bakterie exprimující antigeny spojené s nádorem mohou senzibilizovat TME a překonat vlastní toleranci vyvolanou regulačními T-lymfocyty, a tím vyvolat efektorové a paměťové odpovědi T-buněk vůči nádorovým buňkám produkujícím antigen142,143 . Byla zaznamenána řada antigenů asociovaných s rakovinou prostaty. Vakcíny na bázi bakterií proti prostatickému specifickému antigenu (PSA) byly testovány na několika myších modelech139,144. Dodání endogenního PSA genu pomocí oslabeného S. Typhimurium SL7207 zmírnilo imunitní toleranci vůči antigenům myších kmenových buněk prostaty a významně zpomalilo růst nádoru84. Přístupy genové terapie využívající antigeny proti HER-2/neu143, NY-ESO-183, survivinu88 a Mage-b145 rovněž prokázaly slibné účinky na inhibici nádoru.
Velký zájem se rozvinul v oblasti terapie rakoviny pomocí blokády imunitních kontrolních bodů (immune checkpoint blockade – ICB). Navzdory úspěchům léčby ICB v klinických studiích mají z této léčby prospěch pouze někteří pacienti. Existuje několik příčin rezistence hostitele, které jsou základem tohoto účinku, z nichž nejdůležitější je imunosupresivní TME146,147 . Studie ukazují, že kolonizace nádoru bakteriemi může vyvolat prozánětlivé reakce zahrnující zvýšenou expresi IL-1β, TNF-α a IFN-γ, jakož i aktivaci NK a T-buněk; kombinace ICB a bakteriální terapie proto může překonat rezistenci hostitele131.
Cílení na nádorové stroma
Angiogeneze hraje důležitou roli při růstu nádoru a metastazování. Cílení na nádorovou neovaskularizaci představuje slibný směr pro léčbu rakoviny. Endostatin je 20 kDa C-koncový fragment z kolagenu typu XVIII, který může inhibovat tvorbu nádorových cév v závislosti na dávce bez zjevných vedlejších účinků nebo rezistence na léky148,149 . Xu a spol. klonovali endostatin a siRNA proti signálnímu přenašeči a aktivátoru transkripce 3 (Stat3) v oslabeném kmeni S. Typhimurium. Poté testovali terapeutickou účinnost tohoto kmene u ortotropního HCC a prokázali, že dokáže inhibovat proliferaci a metastazování nádoru, snížit množství nádorové mikrovaskulatury, zvýšit populace CD4+/CD8+ T-buněk a hladiny exprese několika zánětlivých cytokinů (včetně IFN-γ a TNF-α) a snížit expresi TGF-β, regulačních T-buněk a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF)149. VEGF a jeho receptor (VEGFR) regulují nádorovou angiogenezi121,145. Perorální podávání oslabeného S. Typhimurium SL3261 exprimujícího extracelulární doménu VEGFR2 inhibovalo růst nádoru, neovaskularizaci a plicní metastázy. Kromě toho se také významně zvýšilo procento CD4+ a CD8+ T buněk v oblasti nádoru121. Endoglin (CD105) je členem rodiny TGF-β receptorů. TGF-β1 a hypoxie mohou regulovat promotor genu pro endoglin a tento promotor je vysoce aktivní v nádorových endoteliálních buňkách. Proto je endoglin považován za cíl pro léčbu rakoviny150. Paterson a kol. použili vakcíny na bázi listerií proti CD105, Lm-LLO-CD105A a Lm-LLO-CD105B k léčbě rakoviny prsu na myším modelu. Vakcíny stimulovaly silný antiangiogenetický účinek a protinádorovou imunitní odpověď, která inhibovala primární a metastatické nádory151.
Genové umlčování
siRNA, třída 20-25 párů bází dlouhých dvouvláknových RNA, které zprostředkovávají umlčení specifických cílových genů, poskytly slibný přístup k terapii rakoviny. Největší překážkou terapie interferencí RNA je však nutnost specifického doručení siRNA do oblasti nádoru. Na myších nádorových modelech byly testovány systémy na bázi bakterií pro doručování siRNA proti Stat363,122,149,152, IDO153,154, survivinu155, Sox230 a polo-like kináze 1 (PLK1) asociované s buněčným cyklem57 . Perorální podávání oslabeného kmene S. Typhimurium nesoucího eukaryotický expresní plasmid kódující siRNA-Stat3 zvýšilo aktivitu NK buněk a funkci T-lymfocytů a zvýšilo procento CD8+ T buněk, zatímco snížilo počet CD4+ CD25+ regulačních T buněk v nádoru; tyto účinky vedly k inhibici růstu nádoru a prodloužení přežití myší s nádorem122. Umlčení exprese IDO hostitele pomocí kmene S. Typhimurium VNP20009 exprimujícího shIDO vyvolalo významnou infiltraci nádoru polymorfonukleárními neutrofily generujícími ROS, což podpořilo intratumorální buněčnou smrt a podstatnou kontrolu melanomů B16F10153 a kolorektálního karcinomu CT26 nebo MC38156.
.