Este guia é adaptado do Departamento de Bioquímica e Biofísica Molecular da Universidade do Arizona Programa Geral de Biologia para Professores de Ciências: Drosophila Melanogaster e Mendelian Genetics, de Pete Geiger.
Uma introdução à Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster é uma pequena mosca comum encontrada perto de frutos verdes e podres. Está em uso há mais de um século para estudar a genética e o comportamento. Thomas Hunt Morgan foi o biólogo preeminente que estudou Drosophila no início dos anos 1900. Ele foi o primeiro a descobrir a ligação sexual e a recombinação genética, o que colocou a pequena mosca na vanguarda da pesquisa genética. Devido ao seu pequeno tamanho, facilidade de cultivo e curto tempo de geração, os geneticistas têm usado Drosophila desde então.
As moscas de fruto são facilmente obtidas na natureza e muitas empresas de ciências biológicas transportam uma variedade de mutações diferentes. Além disso, estas empresas vendem qualquer equipamento necessário para o cultivo das moscas. Os custos são relativamente baixos e a maioria do equipamento pode ser usado ano após ano. Há uma variedade de exercícios de laboratório que se pode comprar, embora a necessidade de o fazer seja questionável.
Porquê usar Drosophila?
Os professores devem usar moscas da fruta para estudos genéticos do ensino secundário por várias razões:
1. São pequenas e de fácil manuseio.
2. Podem ser facilmente anestesiadas e manipuladas individualmente com equipamentos pouco sofisticados.
3. São sexualmente dimórficas (machos e fêmeas são diferentes), tornando muito fácil diferenciar os sexos.
4. As moscas-da-fruta virgens são fisicamente distintas dos adultos maduros, tornando fácil a obtenção de machos e fêmeas virgens para cruzamentos genéticos.
5. As moscas têm um tempo de geração curto (10-12 dias) e se dão bem à temperatura ambiente.
6. O cuidado e a cultura da mosca da fruta requer pouco equipamento, é de baixo custo e utiliza pouco espaço mesmo para grandes culturas.
Usando Drosophila, os alunos irão:
1. Compreender a genética Mendeliana e herança de características
2. Tirar conclusões dos padrões de hereditariedade a partir dos dados obtidos
3. Construir armadilhas para capturar populações selvagens de D. melanogaster
4. Compreender o ciclo de vida de D. melanogaster, um inseto que apresenta metamorfose completa
5. Construir cruzes de moscas capturadas e conhecidas de tipo selvagem e mutantes
6. Aprender técnicas para manipular moscas, sexá-las e manter notas de diário concisas
7. Aprender técnicas de culto para manter as moscas saudáveis
8. Realizar muitas experiências científicas não podem ser conduzidas e concluídas em uma ou duas sessões de laboratório
Padrões nacionais cobertos nestas lições:
Conteúdo:
1. Os organismos requerem um conjunto de instruções para especificar os traços (hereditariedade)
2. A informação hereditária está localizada nos genes.
3. Combinações de traços podem descrever as características de um organismo.
Bjectivos dos alunos:
1. Identificar questões e conceitos que orientam as investigações científicas
2. Desenhar e conduzir investigações científicas
3. Formular e rever explicações e modelos científicos usando lógica e evidência
4. Comunicar e defender um argumento científico
A genética de Drosophila está bem documentada e vários sites de domínio público apresentam o genoma anotado completo. Portanto, aqueles professores ou alunos que desejam ver onde suas mutações ocorrem têm uma referência pronta disponível.
Desde que Drosophila tem sido tão amplamente utilizada em genética, há muitos tipos diferentes de mutações disponíveis para compra. Além disso, o estudante atento pode encontrar mutações dentro de suas próprias culturas selvagens, pois, devido ao curto tempo de geração, as mutações são relativamente comuns em comparação com outras espécies animais.
Classificação
Domínio: Eukarya
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Classe: Insecta
Pedido: Diptera
Família: Drosophilidae
Génus: Drosophila (“dew lover”)
Espécie: melanogaster (“intestino escuro”)
Ciclo de vida do Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster exibe metamorfismo completo, significando que o ciclo de vida inclui um ovo, forma larval (tipo verme), pupa e finalmente emergência (eclosure) como um adulto voador. Isto é o mesmo que a conhecida metamorfose das borboletas. O estágio larval tem três instars, ou molts.
Dia 0: Fêmea põe ovos
Dia 1: Eclosão dos ovos
Dia 2: Primeiro instar (um dia de duração)
Dia 3: Segundo instar (um dia de duração)
Dia 5: Terceiro e último instar (dois dias de duração)
Dia 7: Larvas começam o estágio deambulação. Pupariação (formação de pupas) ocorre 120 horas após a postura dos ovos
Dia 11-12: Eclosion (adultos emergem do caso da pupa).
As fêmeas tornam-se sexualmente maduras 8-10 horas após a eclosion
– O tempo de geração de Drosophila melanogaster varia com a temperatura. O ciclo acima é para uma temperatura de cerca de 22°C (72°F). As moscas levantadas a uma temperatura mais baixa (até 18°C, ou 64°F) levarão cerca do dobro do tempo para se desenvolverem.
– As fêmeas podem pôr até 100 ovos/dia.
– As fêmeas virgens são capazes de pôr ovos; no entanto serão estéreis e em número reduzido.
Após a eclosão dos ovos, as larvas pequenas devem ser visíveis no meio de crescimento. Se o meio for branco, procure a pequena área preta (os ganchos da boca) na cabeça das larvas. Alguns meios pré-misturados secos são azuis para ajudar a identificar as larvas, contudo isto não é uma necessidade e com um pouco de paciência e prática, as larvas são facilmente visíveis. Além disso, à medida que as larvas se alimentam elas perturbam a superfície lisa dos meios e assim, olhando apenas para a superfície pode-se saber se as larvas estão presentes. Contudo, é sempre uma boa ideia verificar duas vezes usando um microscópio estéreo. Após o terceiro instar, as larvas começarão a migrar para cima do frasco de cultura a fim de pupar.
Cuidado, Manutenção e Manipulação de Drosophila
Introdução
A fim de incorporar moscas da fruta na sala de aula, será necessário manter culturas de moscas para manipulação em cruzamentos e como backup para quaisquer contratempos que possam ocorrer. A cultura é muito fácil e é recomendado que os alunos mantenham as suas próprias culturas de moscas. Dessa forma, cada aluno ou grupo seria directamente responsável pelo cuidado e manutenção a longo prazo das moscas, incluindo a criação de grandes populações de cultura para os seus cruzamentos. Quando diretamente envolvidos, os estudantes ganham proficiência e uma maior compreensão dos requisitos e comportamento das moscas. O professor deve permanecer como treinador, e não como professor, auxiliando os alunos nas técnicas. O instrutor precisa manter culturas de estoque de todas as linhagens e mutantes usadas pelos alunos no caso do incidente imprevisível acima mencionado ocorrer e as culturas dos alunos se extinguirem ou se misturarem. Perder culturas é a exceção e não a regra, e desde que os alunos reculturem suas moscas regularmente e não ocorra contaminação em massa, as moscas podem ser mantidas por décadas.
Bottles and vials
Thomas Hunt Morgan usou garrafas de leite de vidro para suas experiências e, de fato, qualquer recipiente serve, incluindo potes para bebês e recipientes sortidos. No entanto, para facilitar o cultivo e a transferência de culturas, garrafas e frascos uniformes são a melhor abordagem. Ambos podem ser comprados em uma loja de suprimentos biológicos. Os frascos são usados principalmente para a manutenção de grandes populações de moscas, enquanto os frascos de cultura são úteis para a manutenção de populações menores e são o recipiente preferido para a construção de cruzamentos de estudantes. Se existe o desejo de manter as culturas de estoque por um longo período de tempo, ou de reutilizar garrafas e frascos é importante limpá-los e esterilizá-los completamente. Isto é para prevenir surtos de pragas e doenças.
Para limpar garrafas e frascos, primeiro congele-os para matar qualquer mosca dentro deles. Remova os alimentos, lave bem e depois esterilize em autoclave (por 20 minutos a 121°C e 15 psi; se os recipientes forem de plástico, certifique-se de que podem ser autoclavados) ou lavagem em uma solução clorídrica a 10%.
Botes e frascos podem ser adquiridos em uma variedade de tamanhos e materiais. O vidro é eficaz, no entanto, se cair um estudante pode perder 2 semanas de dados em um único derramamento. Os frascos plásticos autoclaváveis (estéreis) estão disponíveis e são preferíveis para uso do aluno. Os tamanhos dos frascos variam de 96 mm por 25 mm até tamanhos maiores, porém o tamanho menor é recomendado para fazer cruzamentos e manter culturas pequenas. Há uma variedade de tampões disponíveis, desde tampões de algodão macio a tampões de espuma. Isto é uma questão de preferência e custos, no entanto o algodão funciona bem e pode ser comprado numa drogaria local numa pitada.
Onde comprar artigos:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, Uma divisão da Genesee Scientific
O que eles parecem:
Estéreo microscópio
Frasco de Drosophila
Garrafas de Drosophila
Fly food
O primeiro passo na preparação de frascos de cultura é adicionar meios de cultura. Há uma variedade de tipos de alimentos disponíveis para as moscas; alguns requerem cozimento e outros são comprados já preparados e desidratados. Estes últimos podem ser comprados a uma empresa de abastecimento biológico. Isto é, claro, muito mais rápido e fácil do que preparar meios cozinhados, tanto que os alunos podem encher os seus próprios frascos com meios. No entanto, deve ser completamente reidratado para obter melhores resultados, já que esta é a única fonte de água para adultos e larvas. Portanto, siga as sugestões abaixo para garantir um meio completamente hidratado:
Meios desidratados
Adicionar meios secos à garrafa ou frasco a cerca de 1/5 a 2/5 de volume. Adicione água até que o meio apareça completamente humedecido. Deixe o frasco sentar durante alguns minutos, adicionando água adicional se necessário, até que o meio esteja completamente hidratado. A superfície deve estar húmida com um aspecto brilhante e não deve haver espaços no meio. Se o meio não estiver completamente hidratado, a produção de culturas vigorosas fica comprometida. As moscas podem ser adicionadas minutos após o meio ter sido hidratado. Lembre-se de adicionar vários grãos (mas não mais) de levedura à superfície do meio antes de adicionar moscas.
Meios de cultura cozidos
Ao distribuir meios de cultura cozidos, deve encher o frasco de cultura, garrafa ou frasco de 1/5 a 2/5 de altura. Mantenha o meio fora durante a noite para curar, mantendo os frascos cobertos com pano para evitar que as moscas selvagens ponham ovos neles. No dia seguinte, adicionar levedura e tampões. Refrigerar os frascos com o material não utilizado. Os meios de cultura cozinhados podem ser guardados em frigorífico durante várias semanas. Deixe o meio aquecer até à temperatura ambiente antes de adicionar as moscas. Não deixe o meio de cultivo secar.
Ambiente
A maneira mais fácil de cultivar moscas é à temperatura ambiente. No entanto, a condição ideal para o cultivo é uma temperatura de 25°C e 60% de umidade. Nessas condições o tempo de geração é menor (9-10 dias do ovo ao adulto). A menos que o equipamento esteja prontamente disponível, isto é desnecessário para o sucesso da criação e do cruzamento de moscas. É preferível manter as moscas fora de correntes de ar e da luz solar directa ou de fontes de calor. Estes secarão rapidamente a mídia, necessitando de mudanças frequentes de mídia e o potencial de desidratar as moscas.
Anestesiar as moscas
O problema com as moscas da fruta é que elas voam! Portanto, foram desenvolvidos vários métodos para anestesiar as moscas. Incluem éter, marcas comerciais como Flynap, dióxido de carbono, e resfriamento. Cada um tem os seus pontos fortes e fracos. O éter é inflamável, tem um odor forte e matará as moscas se elas forem excessivamente aterradas (e podem anestesiar os estudantes mais jovens!). Flynap, da Carolina Biological, é confuso e tem um odor que alguns acham ofensivo. Cada uma delas, no entanto, requer equipamento de baixo custo que pode ser facilmente adquirido. O dióxido de carbono funciona muito bem, mantendo as moscas imóveis por longos períodos de tempo sem efeitos colaterais, porém os tapetes de CO2 (blocos) são caros e uma fonte de CO2 (geralmente uma garrafa) e um sistema de entrega (frascos e braçadeiras) são necessários, aumentando os custos. Se tiver recursos, pode-se usar o CO2 emitido pelos comprimidos Alka-Seltzer para anestesiar as moscas por curtos períodos de tempo. Preparar um grande tubo de ensaio com um sistema de tubo e bujão. Adicione água no tubo e, em seguida, o comprimido Alka-Seltzer. O gás de dióxido de carbono será emitido.
O menos prejudicial para as moscas é o dióxido de carbono ou o anestesiante de arrefecimento. Destas duas opções, o arrefecimento é a mais simples, necessitando apenas de um congelador, gelo e placas de petri. Além disso, é o único método que não afetará a neurologia das moscas, portanto os estudos de comportamento podem começar após as moscas terem aquecido o suficiente.
Anestesiar as moscas por resfriamento
Para incapacitar as moscas, coloque o frasco de cultura no freezer até que as moscas não estejam em movimento, geralmente 8-12 minutos. Despeje as moscas sobre uma superfície fria. Isto pode ser construído usando o topo de uma placa de petri, adicionando gelo picado e depois colocando o fundo da placa de petri em cima. A adição de moscas a este sistema irá mantê-las refrigeradas o tempo suficiente para fazer cada experiência. Basta colocar as moscas de volta no frasco de cultura quando terminar. As moscas “acordarão” relativamente depressa uma vez fora do gelo, por isso mantenha-as frias. Não há efeitos secundários duradouros neste método, embora as moscas deixadas no frigorífico demasiado tempo possam não recuperar. Outra forma de manter as moscas geladas é adicionar água aos sacos de congelação com fecho de correr, colocar no congelador com uma placa de petri aninhada no saco e deixar congelar.
Transferir moscas de um frasco para outro
As moscas devem ser transferidas a cada 10 a 14 dias. Os alunos devem manter uma cultura de reserva das suas moscas e o instrutor deve manter culturas de reserva de todas as estirpes de moscas. Existem duas formas básicas de transferir moscas ao formar novas culturas. Uma não requer anestesia mas sim mãos rápidas.
A) Coloque um funil na boca de um frasco de cultura fresco que já tenha meios de cultura adicionados. No frasco antigo (aquele com moscas dentro), bata suavemente as moscas para baixo, batendo suavemente o frasco numa superfície macia, tal como um tapete de rato. As moscas cairão para o fundo e permanecerão lá por alguns segundos (não mais do que isso!), tempo suficiente para tirar rapidamente a tampa do frasco, invertê-lo no funil e, gentilmente, tampar, juntos, os dois frascos para forçar as moscas a descerem para o novo frasco.
B) Uma maneira alternativa é colocar as moscas no congelador por cerca de 8 minutos. Isto fará com que as moscas caiam num estado de estupor. Depois de colocar um funil no novo frasco, inverta o frasco com as moscas sem movimento para dentro do funil. Isto não é tão divertido mas não terá moscas a voar pela sala de aula.
Voos de sexo
É bastante fácil distinguir os machos das fêmeas e com um pouco de prática os alunos ficarão confiantes da sua capacidade de o fazer. Note que os machos são geralmente menores e têm um abdômen mais escuro e arredondado. A coloração do abdómen é a mais fácil de reconhecer. Além disso, os machos têm pentes de sexo tarsal em seu primeiro par de pernas. Estes são pretos e muito distintos, mas só podem ser vistos com uma ampliação relativamente alta. Com um pouco de prática, ao olhar para o abdómen, os alunos tornar-se-ão proficientes em fazer sexo com precisão com moscas. O sexo com moscas é crítico quando se fazem cruzamentos, por isso certifique-se que os alunos estão confiantes em identificar a diferença entre os sexos. Para que os alunos se sintam confortáveis a fazer sexo com moscas, dê ou faça com que obtenham 25 ou mais moscas de sexo misto e lhes permita separar as moscas em duas pilhas, macho e fêmea. Outros alunos do grupo e o instrutor devem verificar a triagem. Cada membro do grupo deve ser capaz de sexar as moscas.
Fotos de machos e fêmeas
Vista central de um macho (em cima) e fêmea (em baixo).
Vista lateral de um macho (superior) e fêmea (inferior).
Nota o abdómen mais escuro e aparência mais arredondada do macho. As fêmeas também tendem a ser maiores.
Colher fêmeas virgens
Embora seja uma simples questão de colocar fêmeas virgens com machos, é importante reconhecer o fator tempo envolvido para a obtenção de virgens. As fêmeas permanecem virgens por apenas 8-10 horas após o fechamento e devem ser coletadas dentro deste período de tempo. NOTA: As fêmeas têm a capacidade de armazenar esperma após um único acasalamento, portanto se a fêmea para uma cruz não for virgem, você não saberá o genótipo do macho utilizado para a sua cruz. É fortemente sugerido que você obtenha virgens extras caso seja cometido um erro de identificação ou a mosca morra antes que o acasalamento e a mentira do óvulo possam ocorrer. Em uma cultura forte, várias fêmeas virgens devem ser facilmente obtidas. Embora as fêmeas sejam capazes de pôr ovos como virgens, elas serão estéreis e não serão produzidas larvas. Abaixo estão três formas de obter virgens, sendo o ‘método de remoção’ mais encorajado para principiantes.
Método de remoção
Remover todas as moscas 8-10 horas antes da recolha (geralmente isto é feito logo pela manhã). Inspeccionar visualmente a superfície dos alimentos para assegurar a remoção completa das moscas. Após 8-10 horas (geralmente antes de sair do trabalho) recolher todas as fêmeas que estão presentes. Todas serão virgens. Colocar num frasco de cultura fresco e esperar 2-3 dias à procura de larvas. As fêmeas virgens podem pôr ovos, mas serão estéreis. Como são sensíveis ao fotoperíodo, as fêmeas tendem a fechar de manhã cedo. Portanto, as coletas precoces asseguram o maior número de virgens para a experimentação. No entanto, a coleta é possível mais tarde no dia.
Método visual
Ser capaz de reconhecer as fêmeas virgens remove a necessidade de esvaziar os frascos de cultura em tempo hábil e permite aos alunos coletar os seus próprios frascos sem a necessidade de vir à aula em horários estranhos do dia. Note que as fêmeas virgens são muito maiores que as fêmeas mais velhas e não têm a coloração escura das fêmeas maduras. Além disso, nas primeiras horas após o encerramento, será visível uma mancha esverdeada escura (o mecónio, os restos da sua última refeição antes de passar a pupa) na parte inferior do abdómen.
Ciclismo de temperatura
É possível maximizar o número de virgens numa recolha matinal utilizando o ciclismo de temperatura. Quando as culturas são mantidas a uma temperatura de 18°C, o desenvolvimento é retardado para que as fêmeas não acasalem até 16 horas após o fechamento. Ao remover as moscas à tarde/noite e colocar os frascos numa incubadora a 18ºC, 98% das moscas obtidas de manhã serão virgens. Colocando as virgens nos seus próprios frascos durante 2-3 dias eliminarão aqueles 2% que não são virgens.
Fotos de machos e fêmeas virgens:
Uma fêmea recém-fechada. Este é o estágio “molhado” onde a mosca é pegajosa ao toque.
As asas e o corpo têm uma aparência molhada.
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Fêmea virgem mostrando o mecónio (seta).
O mecónio é uma área verde escura e são os restos de alimento larvar
Comparação entre uma fêmea madura (topo) e virgem (fundo). Isto não é muito tempo após o fecho; após 4+ horas torna-se mais difícil distinguir entre os dois.
Nota o mecónio na fêmea virgem.
Comparação entre um macho maduro (superior) e um virgem (inferior). A coloração é semelhante à das fêmeas virgens, no entanto os órgãos genitais são nitidamente diferentes. O mecónio também é encontrado em machos virgens jovens como em fêmeas.
Voagens cruzadas
As fêmeas são consideradas virgens, acrescente os machos. Ao estabelecer cruzamentos, uma proporção de 3:1 de fêmeas virgens para machos é ideal. Geralmente, os machos acasalam mais eficientemente se tiverem amadurecido 3 dias ou mais. Certifique-se de selecionar machos robustos e saudáveis; quanto mais velhos as moscas, menor será a eficiência do acasalamento. O acasalamento ocorre rapidamente e o comportamento é interessante de se observar, mas não será abordado aqui. As fêmeas começam a pôr ovos férteis logo após o acasalamento. Consulte a tabela do ciclo de vida para evidências de larvas de F1. Remova os adultos uma vez estabelecido que existem larvas suficientes (normalmente 7-8 dias após o cruzamento) uma vez que pode não ser capaz de distinguir os pais da geração F1.
Killing Flies: A Morgue
Esta é uma necessidade infeliz quando se usam moscas. Uma garrafa ou copo com água com sabão, ou óleo mineral é geralmente usado. Despeje moscas anestesiadas diretamente na água com sabão ou óleo mineral onde elas se afogam. Uma garrafa (copo, ou frasco com tampa de rosca) cheia com etanol ou isopropanol também pode ser usada como morgue.
Basic Drosophila Genetics Nomenclature and Definitions
Drosophila melanogaster flies têm 4 cromossomas.
O genótipo é escrito como:
Cromossoma
Cromossoma ou Cromossoma / Cromossoma
Esta nomenclatura comum mostra um cromossoma em cima e o seu homólogo em baixo, como os cromossomas apareceriam durante a meiose ao contribuir com gametas.
Quando se escreve o genótipo, em geral, os cromossomas são separados com um ponto e vírgula.
X cromossoma; cromossoma II; cromossoma III; cromossoma IV
O tipo de letra é denotizado como “+” ou WT
Mutações dominantes são escritas com uma letra maiúscula:
Por exemplo: Bar ou B
Mutações recessivas são escritas com uma letra minúscula:
Por exemplo: branco ou w
Mutações são alelos (formas alternativas de um gene ocupando um determinado locus em um cromossomo) que são herdados com cromossomos.
Homozigoto – Um indivíduo com o mesmo alelo em loci correspondente nos cromossomos homólogos.
Heterozigoto – Um indivíduo com diferentes alelos em loci correspondentes nos cromossomos homólogos.
Genótipo – Os genes que um organismo possui.
Fenótipo – Os atributos observáveis de um organismo.
P1 – Geração dos pais.
F1 – Geração de filiação, ou geração de descendência. F1 é a primeira geração de descendentes.
F2 – A segunda geração de descendentes.
Outros grandes recursos web:
Gerard Manning escreveu uma simples introdução à genética Drosophila.
Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System de Karen G. Hales et al (2015).
Cosistema de Pesquisa Drosophila de David Bilder e Kenneth D. Irvine (2017).