Varje DNA-kvantitet och -kvalitet med hjälp av salivinsamling efter konsumtion av mat och dryck

Material och metoder

Vi erhöll godkännande från Air Force Research Laboratory’s institutionella granskningsnämnd för skydd av mänskliga ämnen, protokollnummer FWR20180101H. Försökspersonerna informerades individuellt och undertecknade samtyckesdokument som bevittnades av en tredje part. Prover samlades in från fem försökspersoner med hjälp av Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) och Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Alla insamlade prover samlades in samma dag med minst 30 minuter mellan varje insamling eller under tre dagar på grund av deltagarnas tidsbegränsningar. Två svabbar samlades in per försöksperson; varje svabb gnuggades mot insidan av varje kind i 10-15 s. Sex spottprover samlades in: enligt tillverkarens anvisningar, omedelbart efter att ha druckit vatten, ätit lunch, druckit en kolsyrad läskedryck, druckit en sportdryck eller druckit kaffe.

Svabbarna extraherades med hjälp av Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre). Den första svabben behandlades som den är och den andra renades med Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) med hjälp av mikrocentrifugeringsprotokollet för rening av genomiskt DNA från vävnadskulturcelllysat. Det fanns inget celltvättsteg eftersom proverna redan var i lösning. Spottproverna extraherades med hjälp av QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) med tillverkarens modifierade salivextraktionsprotokoll.

Proverna kvantifierades med NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) och Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) med Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. NanoDrop användes också för att bedöma provernas renhet genom att jämföra absorbansvärdena vid 260 och 280 nm (A260/A280). Båda användes enligt tillverkarens protokoll. Extraherade prover, normaliserade till 10 ng/μL baserat på Qubit-koncentrationer, analyserades med hjälp av en 2 % E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific). Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) tillsammans med High Sensitivity DNA Chip användes för att bestämma kvaliteten på det extraherade DNA:t.

Proverna analyserades sedan på Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) för att testa för två genetiska markörer som är kopplade till jordnötsallergier: rs7192 och rs9275596 . Genotypning med snabb ramp för polymeraskedjereaktion (PCR) inställd på 60 °C i 1 minut, en hållcykel på 95 °C i 10 minuter, 40 cykler på 95 °C i 15 sekunder och sedan 60 °C i 1 minut samt en post-PCR vid 60 °C i 1 minut. TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) användes. SNP-analyserna (single nucleotide polymorphism) användes med halva den koncentration som tillverkaren rekommenderar. Slutvolymen var 10 µl.

Resultat

Svabbextraktionsmetoden med hjälp av QuickExtract-lösningen resulterade i en stor mängd DNA. Värdena för DNA som erhållits från svabben utan ytterligare behandling varierade från 1,38 till 54,2 pg/µL, vilket bestämdes av Bioanalyzer (Additional file 1: Table S1). Tidigare orapporterade resultat från vårt laboratorium visade dock att sekvenseringsexperiment hämmades när bibliotek framställdes direkt från QuickExtract-lösningsextraktionerna. Därför renade vi dessa prover med hjälp av ett Wizard-kolonnreningsprotokoll, vilket minskade koncentrationen som förväntat (från 2,59 till 38,2 pg/µL) och förbättrade A260/A280-förhållandena till närmare det allmänt accepterade intervallet (1,8-2,1).

Spillprover som samlades in enligt tillverkarens protokoll och extraherades med hjälp av QIAamp Blood DNA Kit hade ett intervall på 1,01 ng/μL till 8,20 ng/μL. Den renhet som indikeras av A260/A280-mätningen låg vanligtvis inom intervallet för DNA (se tilläggsfil 1: tabell S1). Inget av de spottprover som samlades in efter att försökspersonerna hade druckit olika drycker eller ätit lunch uppvisade DNA-koncentrationer och renhetsmätningar som skiljde sig signifikant från dem som samlades in med hjälp av tillverkarens protokoll (30 minuters fasta) (fig. 1).

Extraherade prover som normaliserats till 10 ng/μL enligt Qubit 4.0-avläsningar kördes på en 2 % E-Gel med hjälp av en 1-kb ladder (Additional file 1: Figur S1). Vi förväntade oss att se ett band mot toppen av gelen som representerar en DNA-extraktion med hög molekylvikt. Som förväntat hade det extraherade DNA:t från de olika salivinsamlingsmetoderna hög molekylvikt. Trots att de flesta svabbproverna normaliserades till en insats på 10-ng/µL resulterade de inte i ett tydligt band, vilket tyder antingen på förekomst av laddningsinterferenser eller något annat systematiskt problem.

En mer detaljerad analys av storlek och renhet på en Bioanalyzer visade att alla prover och alla förhållanden hade övervägande högmolekylärt DNA och likartade koncentrationer (fig. 2). Förutom den tidigare nämnda låga koncentrationen efter rening av svabbextraktionen finns det inga insamlingsbetingelser (äta eller dricka) relaterade trender i DNA-kvalitet, storlek eller koncentration som blir synliga när man analyserar signalerna i elektroferogrammen. Det verkar finnas en ämnesberoende förändring, även om detta fenomen inte undersöktes vidare.

Slutligen använde vi oss av SNP-genotyper för att testa det extraherade DNA:t för att testa dess lämplighet för molekylära processer i senare led (fig. 3). Alla extraherade prover från alla försökspersoner lyckades ge användbara resultat för genotypning av två SNP:er som är associerade med jordnötsallergi , med undantag för ett av de renade svabbproverna (försöksperson 5B).

Diskussion

När man utformar en genetisk forskningsstudie, en kommersiell produkt eller ett ingrepp inom hälso- och sjukvården är användbarhet och slutanvändarens följsamhet två kritiska faktorer att beakta. Blodprovtagningsanordningar som kräver hudpunktioner kan ha en lägre följsamhet på grund av aversion mot smärta. Genom observationer i vårt labb har vi anekdotiskt märkt att antalet deltagare i studier minskar när den primära skillnaden är venpunktion jämfört med salivprovtagning. Vi har inte genomfört någon kontrollerad studie för att undersöka detta fenomen, utan vi har valt att fortsätta med salivprovtagning på grund av användarvänligheten, den uppenbara ökningen av antalet deltagare och den typ av forskningsstudier som huvudsakligen utförs i vårt laboratorium. Eftersom våra studier omfattar självadministrering av salivprovtagningen har vi försökt fastställa om det finns en tillräckligt hög kvantitet och kvalitet av DNA som kan användas i molekylära tillämpningar i efterföljande led efter olika troliga fältinsamlingsförhållanden, i första hand olika mat- och dryckesintag. Undersökningens utformning var inte avsedd för korsvisa jämförelser mellan olika individer, utan vi försökte snarare jämföra variabiliteten inom en person vid insamling av prover. Med detta mål i åtanke observerade vi ingen signifikant minskning av DNA-mängder som orsakades av variation från tillverkarens instruktioner om att fasta i 30 minuter före insamlingen.

Och även om kvantiteten DNA är viktig, är kvaliteten på det DNA som erhålls mer kritisk för avancerade molekylärbiologiska tekniker. I vår studie fann vi att insamling av salivprover efter att ha ätit och druckit inte påverkade utbytet av DNA med hög molekylvikt. Sådant DNA är avgörande för nästa generations sekvensering, array-scanning och PCR-genotypning. Dessutom visade ett experimentellt test med två oberoende genetiska mål vid PCR-genotypning att dessa prover var mottagliga för molekylära analyser.

Vårt tänkta mål med denna studie var att se om kvaliteten och kvantiteten av DNA från salivinsamling med hjälp av ett saliv-DNA-insamlingskit skulle påverkas av att man inte följer tillverkarens anvisningar, dvs. att man dricker eller äter strax före insamlingen. I enlighet med vår hypotes såg vi ingen skillnad i kvantitet eller kvalitet på det isolerade DNA:t.

Slutsats

Genetiska studier har sträckt sig bortom det rent vetenskapliga området och är numera vanligt förekommande bland konsumentpubliken. För att optimera mänskliga prover för dessa studier strävar tillverkarna efter att utveckla enkla och robusta insamlingsmetoder. Salivprovtagning är den minst invasiva av dessa metoder, ger DNA av hög kvalitet och ger utmärkt produktstabilitet. Vår studie av det DNA som erhålls från saliv efter konsumtion av olika drycker och/eller snacks har visat att det inte finns någon signifikant skillnad i kvantitet och kvalitet på det DNA som samlas in med hjälp av Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix) när proverna inte samlas in enligt tillverkarens protokoll. Även om provstorleken i den här studien är liten, stämmer observationer från andra studier i vårt laboratorium överens med resultaten av vår systematiska jämförelse som presenteras här. Vi drar därför slutsatsen att salivinsamling är ett robust, icke-invasivt sätt att samla in prover både i laboratoriet och i fält, och att kravet på 30 minuter att avstå från mat och dryck är ett ideal och inte ett absolut krav.