The Berg Lab

Denna guide är anpassad från University of Arizona Department of Biochemistry and Molecular Biophysics General Biology Program for Science Teachers: Drosophila melanogaster and Mendelian Genetics, av Pete Geiger.

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster är en liten, vanlig fluga som hittas i närheten av omogen och ruttnad frukt. Den har använts i över hundra år för att studera genetik och beteende. Thomas Hunt Morgan var den framstående biologen som studerade Drosophila i början av 1900-talet. Han var den förste som upptäckte könsbindning och genetisk rekombination, vilket gjorde att den lilla flugan hamnade i framkant av den genetiska forskningen. På grund av dess ringa storlek, enkla odling och korta generationstid har genetiker använt sig av Drosophila ända sedan dess.

Fruktflugor är lätta att få tag på från naturen och många företag inom biologisk vetenskap bär på en mängd olika mutationer. Dessutom säljer dessa företag all utrustning som behövs för att odla flugorna. Kostnaderna är relativt låga och den mesta utrustningen kan användas år efter år. Det finns en mängd olika laboratorieövningar som man kan köpa, även om nödvändigheten av att göra det kan ifrågasättas.

Varför använda Drosophila?

Lärare bör använda fruktflugor för genetiska studier på gymnasiet av flera skäl:
1. De är små och lätta att hantera.
2. De kan lätt bedövas och manipuleras individuellt med okomplicerad utrustning.
3. De är sexuellt dimorfa (hanar och honor är olika), vilket gör att det är ganska lätt att särskilja könen.
4. Jungfruliga fruktflugor skiljer sig fysiskt från mogna vuxna individer, vilket gör det lätt att få tag på jungfruliga hanar och honor för genetiska korsningar.
5. Flugorna har en kort generationstid (10-12 dagar) och klarar sig bra i rumstemperatur.
6. Skötsel och odling av fruktflugor kräver lite utrustning, är billig och tar lite utrymme i anspråk även för stora odlingar.

Med hjälp av Drosophila kommer eleverna att:
1. Förstå mendelsk genetik och arv av egenskaper
2. Dra slutsatser om arvsmönster från erhållna data
3. Konstruera fällor för att fånga vilda populationer av D. melanogaster
4. Få en förståelse för livscykeln hos D. melanogaster, en insekt som uppvisar fullständig metamorfos
5. Konstruera korsningar av fångade och kända vilda och muterade flugor
6. Lär dig tekniker för att manipulera flugor, könsbestämma dem och föra kortfattade dagboksanteckningar
7. Lär dig odlingstekniker för att hålla flugorna friska
8. Inse att många naturvetenskapliga experiment inte kan genomföras och avslutas inom en eller två laborationer

Nationella standarder som omfattas av dessa lektioner:
Innehåll:
1. Organismer kräver en uppsättning instruktioner för att specificera egenskaper (ärftlighet)
2. Ärftlig information finns i gener.
3. Kombinationer av egenskaper kan beskriva en organisms egenskaper.

Studenternas mål:
1. Identifiera frågor och begrepp som styr vetenskapliga undersökningar
2. Utforma och genomföra vetenskapliga undersökningar
3. Formulera och revidera vetenskapliga förklaringar och modeller med hjälp av logik och bevis
4. Kommunicera och försvara ett vetenskapligt argument

Drosophilas genetik är väldokumenterad och på flera offentliga webbplatser finns det fullständiga kommenterade genomet. Därför har de lärare eller elever som vill se var deras mutationer förekommer en färdig referens tillgänglig.

Då Drosophila har använts i så stor utsträckning inom genetiken finns det många olika typer av mutationer att köpa. Dessutom kan den uppmärksamme studenten hitta mutationer i sina egna vildfångade kulturer eftersom mutationer, på grund av den korta generationstiden, är relativt vanliga jämfört med andra djurarter.
Klassificering
Domän: Eukarya
Rike: Animalia
Familj: Arthropoda
Klass: Insecta
Ordning: Diptera
Familj: Drosophilidae
Genus: Drosophilidae
Genus: Drosophilidae: Drosophila (”daggälskare”)
Slag: melanogaster (”mörk tarm”)
Livscykel hos Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster uppvisar fullständig metamorfism, vilket innebär att livscykeln innefattar ett ägg, en larvform (maskliknande form), en puppa och slutligen uppkomst (eclosure) som en flygande vuxen. Detta är samma sak som den välkända metamorfosen hos fjärilar. Larvstadiet har tre stadier, eller skiftningar.

Dag 0: Honan lägger ägg
Dag 1: Äggen kläcks
Dag 2: Första stadiet (ett dygn)
Dag 3: Andra stadiet (ett dygn)
Dag 5: Tredje och sista stadiet (två dygn)
Dag 7: Larverna börjar vandringsstadiet. Pupariation (puppbildning) sker 120 timmar efter äggläggning
Dag 11-12: Honorna blir könsmogna 8-10 timmar efter utkläckning

– Generationstiden hos Drosophila melanogaster varierar med temperaturen. Ovanstående cykel är för en temperatur på ca 22°C (72°F). Flugor som föds upp vid lägre temperatur (till 18°C eller 64°F) tar ungefär dubbelt så lång tid att utvecklas.
– Honor kan lägga upp till 100 ägg/dag.
– Jungfruliga honor kan lägga ägg, men de kommer att vara sterila och få till antalet.

När äggen kläcks bör små larver vara synliga i odlingssubstratet. Om ditt medium är vitt, leta efter det lilla svarta området (munhålskrokarna) vid larvernas huvud. Vissa torkade förblandade medier är blå för att hjälpa till att identifiera larverna men detta är inte nödvändigt och med lite tålamod och övning är larverna lätta att se. När larverna äter upp bryter de dessutom den släta ytan på mediet och genom att bara titta på ytan kan man se om det finns larver. Det är dock alltid en bra idé att dubbelkontrollera med hjälp av ett stereomikroskop. Efter det tredje instariet kommer larverna att börja vandra upp i odlingsflaskan för att förpuppa sig.

Vård, underhåll och manipulering av Drosophila

Introduktion
För att införliva fruktflugor i klassrummet kommer det att vara nödvändigt att upprätthålla kulturer av flugor för manipulering i korsningar och som en backup för eventuella missöden som kan inträffa. Det är mycket enkelt att odla och det rekommenderas att eleverna underhåller sina egna flugkulturer. På så sätt skulle varje elev eller grupp vara direkt ansvarig för skötseln och det långsiktiga underhållet av flugorna, inklusive att göra stora odlingspopulationer för sina korsningar. När eleverna är direkt involverade får de bättre kunskaper och en större förståelse för flugornas krav och beteende. Läraren bör vara en coach, inte en föreläsare, som hjälper eleverna med tekniken. Läraren måste upprätthålla lagerkulturer av alla stammar och mutanter som används av eleverna om den ovan nämnda oförutsägbara händelsen inträffar och elevernas kulturer dör ut eller blandas ihop. Förlust av kulturer är undantaget snarare än regeln, och så länge eleverna återodlar sina flugor regelbundet och ingen masskontaminering sker, kan flugor bevaras i årtionden.
Flaskor och flaskor
Thomas Hunt Morgan använde glasmjölkflaskor för sina experiment, och i själva verket duger vilken behållare som helst, inklusive barnburkar och diverse behållare. För att underlätta odling och överföring av kulturer är dock enhetliga flaskor och flaskor det bästa tillvägagångssättet. Båda kan köpas i en butik för biologisk utrustning. Flaskor används främst för att upprätthålla stora populationer av flugor, medan odlingsflaskor är användbara för att upprätthålla mindre populationer och är den föredragna behållaren för att konstruera studenternas korsningar. Om man vill upprätthålla stamkulturer under en längre tid eller återanvända flaskor och flaskflaskor är det viktigt att de rengörs och steriliseras fullständigt. Detta för att förhindra utbrott av skadedjur och sjukdomar.

För att rengöra flaskor och ampuller ska du först frysa dem för att döda eventuella flugor i dem. Ta bort maten, tvätta väl och sterilisera sedan genom autoklavering (i 20 minuter vid 121 °C och 15 psi; om behållarna är av plast, försäkra dig om att de kan autoklaveras) eller genom att tvätta dem i en 10-procentig klorbleklösning.

Flaskor och flaskor kan köpas i en mängd olika storlekar och material. Glas är effektivt, men om det tappas kan en elev förlora två veckors data i ett enda spill. Autoklaverade (sterila) plastflaskor finns tillgängliga och är att föredra för studentanvändning. Flaskstorlekarna varierar från 96 mm x 25 mm till större storlekar, men den mindre storleken rekommenderas för att göra korsningar och upprätthålla små kulturer. Det finns en mängd olika proppar tillgängliga, från mjuk bomull till skumproppar. Detta är en fråga om preferenser och kostnader, men bomull fungerar bra och kan köpas på ett lokalt apotek i en nödsituation.
Var kan man köpa förnödenheter:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, A division of Genesee Scientific
Hur de ser ut:

StereomikroskopDrosophilaflaskaDrosophilaflaskor

Flugfoder
Det första steget i förberedelserna av odlingsflaskorna är att tillsätta matmedia. Det finns en mängd olika typer av mat tillgängliga för flugorna; vissa kräver tillagning och andra köps redan förberedda och dehydrerade. De sistnämnda kan köpas från ett företag som tillhandahåller biologiska produkter. Detta är naturligtvis mycket snabbare och enklare än att förbereda kokta medier, så mycket att eleverna kan fylla sina egna flaskor med medier. Det måste dock vara helt rehydrerat för bästa resultat, eftersom detta är den enda vattenkällan för vuxna djur och larver. Följ därför förslagen nedan för att säkerställa ett fullständigt hydrerat media:

Dehydrerat media
Häll torrt media i flaskan eller flaskan till ungefär 1/5 till 2/5 volym. Tillsätt vatten tills mediet verkar helt fuktat. Låt flaskan sitta i några minuter och tillsätt ytterligare vatten vid behov tills mediet är helt hydratiserat. Ytan ska vara fuktig med ett glänsande utseende och det ska inte finnas några mellanrum i mediet. Om mediet inte är fullständigt hydratiserat äventyras produktionen av livskraftiga kulturer. Flugor kan tillsättas några minuter efter det att mediet har hydrerats. Kom ihåg att tillsätta flera korn (men inte mer) jäst till medieytan innan du tillsätter flugor.

Kokta medier
När du delar ut kokta medier ska det fylla kulturflaskan, flaskan eller vialen 1/5 till 2/5 full. Förvara mediet ute över natten för att härda, håll flaskorna täckta med tyg för att hindra vilda flugor från att lägga ägg i dem. Nästa dag tillsätter du jäst och proppar. Kyl alla oanvända flaskor med media i kylskåp. Kokta medier kan förvaras i kylskåp i flera veckor. Låt medierna värmas upp till rumstemperatur innan du tillsätter flugor. Låt inte medierna torka ut.
Miljö
Det enklaste sättet att odla flugor är i rumstemperatur. Det optimala odlingsförhållandet är dock en temperatur på 25 °C och 60 % luftfuktighet. Under dessa förhållanden är generationstiden kortare (9-10 dagar från ägg till vuxen). Om inte utrustningen är lättillgänglig är detta onödigt för framgångsrik uppfödning och korsning av flugor. Det är att föredra att hålla flugorna borta från drag och direkt solljus eller värmekällor. Dessa kommer snabbt att torka ut medierna, vilket kräver frekventa byten av medier och kan leda till att flugorna uttorkas.
Anestesi av flugor
Problemet med fruktflugor är att de flyger! Därför har olika metoder utvecklats för att söva flugor. Bland annat finns eter, kommersiella märken som Flynap, koldioxid och kylning. Var och en har sina styrkor och svagheter. Eter är lättantändligt, har en stark lukt och dödar flugor om de är överbedövade (och kan bedöva yngre elever!). Flynap, från Carolina Biological, är kladdigt och har en lukt som vissa tycker är stötande. Var och en av dessa kräver dock billig utrustning som lätt kan köpas. Koldioxid fungerar mycket bra och håller flugor orörliga under långa perioder utan biverkningar, men CO2-mattor (block) är dyra och en CO2-källa (vanligtvis en flaska) och ett leveranssystem (flaskor och klämmor) är nödvändiga, vilket ökar kostnaderna. Om man är påhittig kan man använda den koldioxid som avges från Alka-Seltzer-tabletter för att söva flugor under korta perioder. Ställ upp ett stort provrör med ett rör- och proppsystem. Tillsätt vatten i röret och sedan Alka-Seltzer-tabletten. Koldioxidgas kommer att avges.

Det minst skadliga för flugorna är antingen koldioxid eller kylbedövning. Av dessa två alternativ är kylning det enklaste och kräver endast en frys, is och petriskålar. Dessutom är det den enda metod som inte påverkar flugornas neurologi, därför kan beteendestudier påbörjas efter att flugorna har värmts upp tillräckligt.
Bedövning av flugor genom kylning
För att oskadliggöra flugorna placeras odlingsflaskan i frysen tills flugorna inte rör sig, i allmänhet 8-12 minuter. Dumpa flugorna på en kyld yta. Detta kan konstrueras genom att använda toppen av en petriskål, lägga till krossad is och sedan placera botten av petriskålen ovanpå. Genom att lägga flugorna i detta system hålls de kylda tillräckligt länge för att utföra varje experiment. Placera bara flugorna tillbaka i odlingsflaskan när du är klar. Flugorna ”vaknar” relativt snabbt när de inte längre ligger på isen, så håll dem kalla. Det finns inga långvariga biverkningar av denna metod, även om flugor som lämnas i kylskåpet för länge kanske inte återhämtar sig. Ett annat sätt att hålla flugorna kylda är att tillsätta vatten i fryspåsar av zip-lock-typ, placera dem i frysen med en petriskål inbäddad i påsen och låt dem frysa.
Överföring av flugor från en injektionsflaska till en annan
Flygorna bör överföras var 10:e till 14:e dag. Eleverna bör upprätthålla en säkerhetskultur av sina flugor och instruktören bör upprätthålla säkerhetskulturer av alla flugstammar. Det finns två grundläggande sätt att överföra flugor när man bildar nya kulturer. Det ena kräver ingen bedövning men snabba händer.
A) Placera en tratt i munnen på en ny odlingsflaska som redan har tillsatts media. I den gamla flaskan (den med flugor i), knacka försiktigt ner flugorna genom att mjukt stampa flaskan mot en mjuk yta, t.ex. en musmatta. Flugorna kommer att falla till botten och stanna där i några sekunder (inte mer än så!), tillräckligt med tid för att snabbt ta bort proppen från flaskan, vända den i tratten och försiktigt tamponera, tillsammans, de två flaskorna för att tvinga ner flugorna i den nya flaskan.
B) Ett alternativt sätt är att lägga flugorna i frysen i cirka 8 minuter. Detta kommer att få flugorna att hamna i ett tillstånd av dvala. Efter att ha placerat en tratt på den nya flaskan vänds flaskan med orörliga flugor ner i tratten. Detta är inte lika roligt men du kommer inte att ha några flugor som flyger runt i klassrummet.
Könsbestämning av flugor
Det är ganska lätt att skilja hanar från honor och med lite övning kommer eleverna att bli säkra på sin förmåga att göra det. Lägg märke till att hanar i allmänhet är mindre och har en mörkare och mer rundad buk. Färgningen på buken är lättast att känna igen. Dessutom har hanarna tarsala könskammar på sitt första par ben. De är svarta och mycket karakteristiska, men kan bara ses med relativt hög förstoring. Med lite övning kan eleverna genom att titta på buken bli duktiga på att exakt könsbestämma flugor. Det är viktigt att könsbestämma flugor när man gör korsningar, så se till att eleverna är säkra på att identifiera skillnaden mellan könen. För att eleverna ska känna sig bekväma med att könsbestämma flugor, ge dem eller låt dem skaffa 25 eller fler flugor av blandat kön och låt dem sortera flugorna i två högar, hanar och honor. Andra elever i gruppen och läraren bör kontrollera sorteringen. Varje medlem i gruppen bör kunna könsbestämma flugor.
Bilder på hanar och honor

Bemärk hanens mörkare buk och mer rundade utseende. Honorna tenderar också att vara större.
Samla in jungfruliga honor
Som det är en enkel sak att placera jungfruliga honor tillsammans med hanar är det viktigt att inse tidsfaktorn för att få tag på jungfruliga honor. Honorna förblir jungfruliga i endast 8-10 timmar efter utläggning och måste samlas in inom denna tidsram. OBS: Honorna har förmågan att lagra sperma efter en enda parning, så om honan för en korsning inte är jungfru vet du inte genotypen hos den hane som används för din korsning. Det rekommenderas starkt att du skaffar extra jungfrur om ett misstag görs vid identifieringen eller om flugan dör innan parning och äggläggning kan ske. I en stark kultur bör det vara lätt att få fram flera jungfruliga honor. Även om honorna kan lägga ägg som jungfrur kommer de att vara sterila och inga larver kommer att produceras. Nedan beskrivs tre sätt att få fram jungfrur, där ”borttagningsmetoden” är den som uppmuntras mest av nybörjare.
Borttagningsmetoden
Borttag alla flugor 8-10 timmar före insamlingen (i allmänhet görs detta först på morgonen). Kontrollera matens yta visuellt för att se till att alla flugor har avlägsnats. Efter 8-10 timmar (vanligtvis innan du lämnar arbetet) samla in alla honor som finns. Alla kommer att vara jungfrur. Placera dem i en ny odlingsflaska och vänta 2-3 dagar för att leta efter larver. Jungfruliga honor kan lägga ägg, men de kommer att vara sterila. Eftersom de är fotoperiodkänsliga tenderar honorna att lägga ägg tidigt på morgonen. Tidiga insamlingar garanterar därför det största antalet jungfruliga honor för experiment. Det är dock möjligt att samla in senare på dagen.
Visuell metod
Att kunna känna igen jungfruliga honor tar bort behovet av att tömma odlingsflaskorna i tid och gör det möjligt för eleverna att samla in sina egna utan att behöva komma till lektionen vid udda tider på dagen. Observera att jungfruliga honor är mycket större än äldre honor och inte har den mörka färgningen hos mogna honor. Dessutom kommer det under de tidiga timmarna efter utläggning att synas en mörkgrönaktig fläck (meconium, resterna av deras sista måltid innan de förpuppar sig) på undersidan av buken.
Temperaturcykling
Det är möjligt att maximera antalet jungfrur i en morgonsamling genom att använda sig av temperaturcykling. När odlingar hålls vid en temperatur på 18 °C saktas utvecklingen ner så att honorna inte parar sig förrän 16 timmar efter insjunkning. Genom att ta bort flugor på eftermiddagen/kvällen och placera flaskorna i en inkubator vid 18 °C kommer 98 % av de flugor som erhålls på morgonen att vara jungfrur. Genom att placera jungfrurna i sina egna flaskor i 2-3 dagar elimineras de 2 % som inte är jungfrur.
Bilder på jungfruliga hanar och honor:

Korsning av flugor
När honorna anses vara jungfruliga, lägg till hanar. När man sätter upp korsningar är ett 3:1-förhållande mellan jungfruliga honor och hanar idealiskt. Generellt sett kommer hanar att para sig effektivare om de har mognat 3 dagar eller längre. Se till att välja robusta, friska hanar; ju äldre flugorna är, desto sämre parningseffektivitet. Parningen sker snabbt och beteendet är intressant att titta på, men kommer inte att behandlas här. Honorna börjar lägga fertila ägg strax efter parningen. Se livscykeldiagrammet för bevis på F1-larver. Ta bort de vuxna när det har konstaterats att det finns tillräckligt många larver (vanligtvis 7-8 dagar efter korsningen) eftersom du kanske inte kan skilja föräldrarna från F1-generationen.
Döda flugor: Detta är en olycklig nödvändighet när man använder flugor. En flaska eller bägare med tvålvatten eller mineralolja används i allmänhet. Dumpa bedövade flugor direkt i tvålvattnet eller mineraloljan där de drunknar. En flaska (bägare eller burk med skruvlock) fylld med etanol eller isopropanol kan också användas som bårhus.
Grundläggande nomenklatur och definitioner inom drosophilagenetiken

Drosophila melanogaster-flugor har 4 kromosomer.
Genotypen skrivs som:

Kromosom
Kromosom eller kromosom/kromosom

Denna vanliga nomenklatur visar en kromosom upptill och dess homolog nedtill, så som kromosomerna skulle se ut under meiosen när de bidrar med könsceller.

När man skriver genotypen separeras kromosomerna i allmänhet med ett semikolon.

X-kromosom; kromosom II; kromosom III; kromosom IV

Vildtyp betecknas med ”+” eller WT

Dominanta mutationer skrivs med stor bokstav:
Till exempel: Exempel: Bar eller B

Recessiva mutationer skrivs med liten bokstav:
Till exempel: white eller w

Mutationer är alleler (alternativa former av en gen på en given plats på en kromosom) som ärvs tillsammans med kromosomerna.

Homozygot – En individ med samma allel på motsvarande platser på de homologa kromosomerna.

Heterozygot – En individ med olika alleler vid motsvarande loci på de homologa kromosomerna.

Genotyp – De gener som en organism besitter.

Fenotyp – De observerbara egenskaperna hos en organism.

P1 – Föräldrageneration.

F1 – Filialgeneration, eller avkommegeneration. F1 är den första avkomman.

F2 – Den andra avkomman.
Andra bra webbresurser:

Gerard Manning har skrivit en enkel introduktion till Drosophila genetik.

Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System av Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem av David Bilder och Kenneth D. Irvine (2017).