PMC

Syrgas (O2) utvecklas under fotosyntetisk elektrontransport när vatten delas av det syreutvecklande komplexet för att ge protoner och elektroner till den kloroplastiska elektronkedjan och därigenom generera ATP och NADPH – energikällan och den reducerande kraften för växternas ämnesomsättning. Merparten av denna kemiska energi används för att driva den fotosyntetiska kolmetabolismen, som består av ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylering (fotosyntetisk kolreduktionscykel) och syresättning (fotosyntetisk koloxidationscykel), med ett kombinerat elektronbehov = JA. Fyra elektroner krävs för varje O2 som utvecklas, så att bruttoproduktionen av O2 (GOP) är relaterad till den linjära elektrontransporten (J) enligt J/4. När linjär elektrontransport endast används för att driva CO2-fixering är förbrukningen av O2 och frigörandet av CO2 genom fotosyntetisk koloxidation och mitokondriell respiration sådan att nettoproduktionen av O2 (NOP) är lika med nettoassimileringen av CO2 (Anet), förutsatt att den respiratoriska kvoten är 1, men se Tcherkez et al, 2017).

Också elektroner kan användas för alternativ icke-cyklisk elektrontransport (ANCET), inklusive till exempel fotoreduktion av O2 som i sig själv bildar reaktiva syrearter (Mehler-peroxidasreaktioner eller ”vatten-vattencykeln”; Asada, 1999), kloroplastisk anabolism (t.ex. lipider; Stumpf et al, 1963), reduktion av oxaloacetat till malat (som exporteras till mitokondrierna; Scheibe, 2004) och kväveassimilation (Bloom et al., 1989). ANCET har antagits både som ett sätt att reglera ATP/NADPH-förhållandet för att möta de förändrade energibehoven i den cellulära ämnesomsättningen och som en mekanism för att förhindra fotoskador genom att använda överskott av reduktionsmedel när fotonflödestätheten överstiger energibehovet för CO2-fixering (t.ex. vid hög irradians, kalla temperaturer, vattenstress som stänger stomata; t.ex. Badger, 1985; Ort och Baker, 2002; Robinson, 1988). Viktigt är att det inte finns några formella bevis för hur elektronflöden interagerar, särskilt under fluktuerande ljusförhållanden (Morales et al., 2018).

Då ANCET gör det möjligt att upprätthålla högre hastigheter av linjär elektrontransport, kommer den totala elektrontransporten (Jt) att vara större än JA. Omvänt kommer effekten på O2-upptaget att vara beroende av vilken metabolisk väg som är involverad. I Mehler-peroxidasreaktionerna finns det t.ex. ingen nettoförändring av O2, så NOP kommer att förbli lika med Anet. Men vid reduktion av nitrat är förhållandet mellan N-bunden O2-produktion och O2-konsumtion starkt beroende av den syntetiserade aminosyran (Noctor och Foyer, 1998). I detta fall kommer NOP inte alltid att vara lika med Anet eftersom O2 och CO2 kanske inte är balanserade i metabolismen (Skillman, 2008). Följaktligen är samtidiga mätningar av CO2- och O2-flöden viktiga för att förstå hur växter reglerar användningen av ljusenergi, där olika öden har mycket olika metaboliska resultat.

De tidigaste mätningarna av O2-utvecklingen kunde inte skilja GOP från upptag av O2 (Hill, 1937). Den masspektrometriska metod som etablerades av Mehler och Brown (1952) löste detta problem genom att använda spårämnen för O2-isotoper för att oberoende övervaka flöden av 16O2 och 18O2. I denna metod tillfördes rent 18O2 till gasutrymmet i en sluten kammare, och minskningen av 18O2 tillskrivs O2-upptag. O2 som utvecklas har samma isotopsammansättning som det vatten från vilket det genereras; i detta fall var den dominerande isotopen i vattnet 16O (fig. 1). 18O-märkningsmetoden tillämpades vidare på bladskivor (t.ex. Tourneux och Peltier, 1995), hela bortklippta blad (t.ex. Volk och Jackson, 1972) och hela växter (Gerbaud och André, 1980), vilket belyste O2:s öde in vivo.

Begränsningen av slutna gasutbytessystem är att mätningar endast kan utföras under korta tidsperioder (sekunder till minuter) innan CO2-koncentrationen är uttömd. Följaktligen är CO2:O2 inte konstant, vilket förändrar de relativa hastigheterna för karboxylering och syresättning så att uppskattningar av GOP- och O2-upptag blir felaktiga. Denna begränsning övervanns i masspektrometrimetoden genom att ersätta förbrukad CO2 genom periodiskt inflöde av CO2 till kammaren, vilket möjliggör en kvantifiering av steady-state och utökar möjligheten att mäta O2-flöden under en rad olika förhållanden och fysiologiska tillstånd (Canvin et al., 1980). Samtidigt gjordes framsteg i användningen av klorofyllfluorescens, som ger information om PSII:s kvantutbyte (Baker, 2008). Genty et al. (1989) tillhandahöll den empiriska kopplingen mellan fluorescens och elektrontransporthastighet, vilket ersatte behovet av att direkt mäta O2-utvecklingen. Klorofyllfluorescens är nu en av de mest populära teknikerna inom växtfysiologin på grund av dess användarvänlighet och relativt låga kostnad. Detta har underlättats av möjligheten att multiplexa fluorescensmätningar med H2O- och CO2-gasutbyte i bärbara, kommersiellt tillgängliga instrument, vilket ger möjlighet att mäta växternas funktion utanför laboratoriet. Följaktligen har in vivo-mätningar av O2-flöden minskat avsevärt under de senaste 20 åren.

I det här numret av Plant Physiology påminner Gauthier et al. (2018) oss om varför det är så viktigt att återvända till O2 och förser oss med ett nytt, elegant system med öppen väg för att mäta O2-flöden. Deras metod är ett ”omvänt” isotopiskt tillvägagångssätt, vilket innebär 18O-märkning av bladvatten i stället för luft, så att den isotopiska sammansättningen av O2 som utvecklas under vattenspjälkning har en signatur som skiljer sig mycket från den för omgivande O2 (fig. 1). Det är absolut nödvändigt att använda en betydande 18O-anrikning eftersom bidraget från NOP i en bakgrund med 21 % O2 sannolikt är i storleksordningen 0,05 % (t.ex. 100 μmol mol-1 NOP/210 000 μmol mol-1 omgivande O2), vilket gör det svårt att i vanliga fall exakt detektera en förändring av δ18O hos O2 i samband med NOP i luften som omger bladet.

Metoden är fortfarande mycket teknisk, eftersom den kräver att man använder tre högprecisionsinstrument. Den isotopiska sammansättningen och koncentrationen av CO2- och H2O-ångor mäts med laserspektroskopi och δ18O2 och δO2/N2 (för att uppskatta O2-koncentrationen) med masspektrometri. Det krävs också en specialtillverkad kammare för att hysa det utskurna bladet och dess 18O-märkta vattenkälla, vilket bidrar till att förhindra läckage över packningarna från runt bladskaftet. Viktigt är att det öppna gasutbytessystemet förbättrar förmågan att uppnå steady-state-mätningar, och märkning av vatten jämfört med användning av ren 18O2-gas löser problemet med överkomliga priser, vilket i hög grad har begränsat införandet av öppna system.

Medans klorofyllfluorescens har blivit ett populärt alternativ för att mäta elektrontransporthastighet, är det inte utan antaganden. Det antas till exempel ofta att bladen absorberar 84 % av de infallande fotonerna och att 50 % av dessa fotoner absorberas av PSII, men detta är kanske inte alltid fallet (Baker, 2008). Detta kan leda till en överskattning av elektrontransporthastigheten när den beräknas från fluorescens jämfört med mätningar av GOP. Dessutom är en noggrann bestämning av JA särskilt relevant för uppskattning av mesofyllkonduktans, vilket var en tillämpning som lyftes fram av Gauthier et al. (2018). Mehler-peroxidasreaktionerna, som har visat sig ligga mellan 0 % och 30 % (Driever och Baker, 2011), skulle leda till en överskattning av elektronflöden i samband med de fotosyntetiska kolreduktions-/oxygeneringscyklerna i båda metoderna. Fördelen med isotopmärkningsmetoden är dock att Mehlerreaktionens bidrag till bruttoproduktionen av O2 kan kvantifieras genom att koppla mätningar av GOP till NOP (t.ex. Furbank et al., 1982; se fig. 1). Nu när vi har en förnyad förmåga att mäta O2-flöden bör dessa antaganden inte ignoreras.

Förutom att förstå avvägningen mellan effektivitet och fotoskydd för förbättrad jordbruksproduktion (Murchie och Niyogi, 2011) har de olika elektronfaten viktiga implikationer för förståelsen av globala O2-flöden. Framför allt har O2-upptag i samband med fotorespiration, mitokondriell respiration och Mehler-peroxidasreaktionerna olika isotopfraktioneringsfaktorer (Guy et al., 1993), så att kvantifiering av flöden från enskilda vägar behövs för att begränsa uppskattningar av den globala primärproduktionen från δ18O-information (Welp et al, 2011).

Det är hög tid att vi återigen ser över mätningen av O2-flöden, och den nya metod som utvecklats av Gauthier et al. (2018) ger oss den nödvändiga kapaciteten för att göra det.