DNEs IN TRANSCRIPTIONAL REGULATION
DNEs kan också uppstå i samband med transkriptionell reglering. En DNE kan t.ex. erhållas genom att man tar bort transaktiveringsdomänen från en modulär TF och bara lämnar kvar DNA-bindningsdomänen. Denna trunkerade faktor kan uppträda som en kompetitiv hämmare av transkription. Det är känt att detta förekommer i naturen. Till exempel uttrycks C/EBP-proteinet hos däggdjur som tre alternativa polypeptider. De längre polypeptiderna innehåller en N-terminal transkriptionsaktiveringsdomän, medan den korta formen saknar den. Eftersom de långa och korta isoformerna samlas till homo- och heterodimerer beter sig den senare som en naturlig DN (Zahnow et al., 1997). Detta är också fallet för Stats 5 och 6 hos ryggradsdjur, som kan dimerisera. Deras proteolytiska bearbetning som svar på fysiologiska signaler leder till att den C-terminala aktiveringsdomänen avlägsnas och omvandlar dem till kraftfulla hämmare som negativt reglerar signaltransduktionen (Nakajima et al., 2003). I växter fungerar ett stort antal MYB-proteiner som transkriptionsregulatorer. I Arabidopsis är proteiner som innehåller en enda MYB DNA-bindningsrepetition men saknar transaktiveringsdomänen involverade i att specificera aspekter av epidermala cellöden. Dessa proteiner interagerar med andra TFs, inklusive bHLH-proteiner, och på grund av avsaknaden av en transaktivatordomän beter de sig som DN och trans-DNs genom att bilda inaktiva komplex (Ramsay och Glover, 2005).
Försvinnande av den DNA-bindande domänen kan också leda till DNEs. Detta sker i bHLH TFs. Som nämnts ovan kodar Id-1-genen för en naturligt förekommande DN-hämmare av denna familj av TFs. Kompletta bHLH-proteiner (med DNA-bindnings- och dimeriseringsdomäner) kan uttryckas konstitutivt. Det reglerade uttrycket av Id-1, som endast innehåller dimeriseringsdomänen, medför dock en reglering av bHLH-proteinernas aktivitet (Sun, 1994). Ett liknande fenomen förväntas också i växter. Arabidopsis arvsmassa kodar till exempel för ∼120 bHLH-proteiner som förutspås binda DNA och 27 proteiner med en mindre basisk region än vad som krävs för bindning (Toledo-Ortiz et al., 2003). Dessa icke-DNA-bindande HLH:er kan fungera som djurens Id-proteiner, som negativa regulatorer av bHLH-proteiner genom bildandet av heterodimerer som inte kan binda DNA (Toledo-Ortiz et al., 2003). Liknande effekter förväntas i TF:er som tillhör familjen basic domain/leucine zipper (bZIP), som innehåller ett grundläggande DNA-bindningsmotiv, en leucine zipper dimeriseringsdomän och domäner för transaktivering. Arabidopsis kodar för 67 bZIP-proteiner, som alla förutspås fungera som homo- och/eller heterodimerer (Deppmann et al., 2004). Några av dessa är mycket små och kan sakna aktiveringsdomäner. I ett klassiskt exempel hos växter belyste Fukazawa et al. (2000) funktionen hos bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) i gibberellinsignalering genom att använda en DN-form av RSG, som saknade en transkriptionsaktiveringsdomän och därför fungerade för att undertrycka funktionen hos vildtypproteinet när det uttrycktes i transgen tobak. Dessutom, i linje med vad som sagts i avsnittet som behandlar trans-DNs genom överuttryck, är DNA-proteintranskriptionskomplex också känsliga för balansen i gendoseringen (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Förändringar av denna balans genom minskat eller ökat uttryck av en TF i förhållande till andra som är involverade i samma komplex kan inducera onormala fenotyper.
En enkel modell för transkriptionsaktivering kan användas för att utforska vissa kvantitativa subtiliteter av DN-mutationer i detta sammanhang. Studier av virala system och Drosophila har visat att transkriptionen ofta uppvisar ett sigmoidalt förhållande med avseende på koncentrationen av en TF. När det gäller ett system som reagerar på en enda typ av aktivator (A) kan detta sigmoidala svar delas upp i två huvudkomponenter: kooperativ bindning av A till promotorn (p) för en målgen och synergi (figur 6). Synergin är resultatet av de samordnade interaktionerna mellan de molekyler av A som redan är bundna till promotorn och transkriptionsmaskineriet (Carey, 1998; Veitia, 2003).
DNE:er i transkriptionen.
(A) Promotor med två bindningsställen (grå trianglar) som erkänns på ett samarbetsvilligt sätt av aktivatorn A eller dess trunkerade form a, som uppför sig som en konkurrensinhibitor.
(B) Samarbetsförmågan kan bero på den samordnade attraktionen av en inkommande monomer av A som sitter på DNA och en angränsande DNA-plats.
(C) Synergi: två monomerer som sitter på sina DNA-bindningsställen kommer att attrahera polymeraset (pol) mycket starkare än endast en monomer som är bunden till DNA. Synergin störs när en monomer saknar den polymerasrekryterande domänen.
Tänk på en promotor, p, som innehåller två bindningsställen för A. Samma bindningsställen känns också igen av varianten a, som kan fungera som en kompetitiv hämmare. Vi antar att det kan finnas kooperativitet under interaktionen mellan A-molekylerna och promotorn. Detta kan också vara fallet för interaktionerna mellan A, a och promotorn. En möjlig källa till kooperativitet nämndes ovan (dvs. A tenderar att bilda dimerer i lösning, men detta förstärks under DNA-bindning). En annan möjlighet är att monomerer inte kan interagera i lösning och att interaktion mellan en monomer och DNA leder till en allosterisk förändring som ökar den bundna A:s affinitet för en inkommande monomer. Det är också möjligt, även om det är mindre troligt, att det inte finns några A-A-interaktioner och att bindningen av en monomer till DNA leder till en förändring i den närliggande platsen som ökar dess affinitet för en nytillkommen monomer. Oavsett vad som händer innebär kooperativitet att reaktionen pA + A = pAA inträffar lättare än p + A = pA.
På grund av förekomsten av synergi är den molekylära art som bidrar mest till transkriptionen den promotor som upptas av två molekyler av aktivatorn: pAA. Detta innebär också att om affinitetskonstanten för associeringen mellan komplexet pA och polymeraset är KpolA, kommer K för associeringen mellan pAA och polymeraset att vara mycket högre än 2K (i storleksordningen K2polA; se Zlotnick, 1994). För att tillgodose partiell transaktiveringsaktivitet i denna modell kommer vi att använda Kpola (för reaktionen pa + pol) och Kpola2 (för paa + pol). Under dessa antaganden kan en ekvation för transkriptionssvaret (TR) som en funktion av koncentrationen av A (och a) härledas enligt Veitia (2003) och Veitia och Nijhout (2006) (se Supplemental Materials online).
Med en ganska enkel ekvation i handen kan flera förhållanden undersökas: (1) Wildtyp-situationen A/A, (2) när det saknas en allel (A/-) och (3) när det finns samexpression av A och en trunkerad version a som saknar transaktiveringsdomänen. I det senare fallet kan vi skilja mellan två olika situationer: (3a) när mutationen av a upphäver kooperativiteten eller (3b) när A och a interagerar kooperativt. Slutligen kan vi också undersöka en situation (4) där transaktiveringskapaciteten hos a är normal och kooperativiteten saknas, och (5) när kooperativiteten är normal men transaktiveringskapaciteten är partiell.
Figur 7 visar att a TR, i förhållande till promotorns maximala utgång, kontra uppvisar ett sigmoidalt förhållande, som sträcker sig mellan 0 och 1. Mättnad återspeglar systemets maximala respons, men detta innebär inte att promotorn endast fungerar vid mättnad. Enligt figuren, och i allmänhet, är värdena på kurvan för heterozygoten A/- vid varje punkt lägre än för A/A (för varje värde av relativ , har heterozygoten A/- två gånger mindre i absoluta tal än vildtypen). Intressant nog är förskjutningen mellan kurvorna vid låga relativa koncentrationer av A mycket uttalad Y(A/-) är ∼25 % av Y(A/A). Som intuitivt förväntat uppnås dock för höga värden av A mättnad även i A/-. Om detta system var normalt funktionellt vid låga koncentrationer av A skulle en individ A/- uppvisa en typisk haploinsufficient fenotyp.
TR för en promotor (med två platser) till aktivatorn A ensam eller samtryckt (i ekvimolära mängder) med dess DN-form a.
Grafen representerar TR som en funktion av produktionen av A (a) per allel i förhållande till en maximal produktion. Utgången i form av koncentrationer av A (a) beror direkt på styrkan (varaktigheten) av en signal som driver produktionen av A (a). I det särskilda fallet med heterozygoten A/- kommer den för varje värde av x att ha två gånger mindre A-protein än A/A. Därför är värdena för TR för heterozygoten A/- vid varje punkt (ljusblått) lägre än för den normala A/A (mörkblått), men för höga värden på A uppnås mättnad. I A/a när a saknar transaktiveringsförmåga i avsaknad av kooperativitet mellan A och a, finns det en tendens att nå mättnad med ökande koncentrationer av A och a, eftersom den förstnämnda tenderar att ockupera promotorn genom att kooperativt rekrytera andra molekyler av A (rosa). När kooperativiteten mellan A och a bibehålls nås kurvans platå för A/a vid TR = 0,25 (grönt) eftersom den transkriptionellt aktiva arten pAA endast utgör 25 % av den totala mängden. När det finns kvarvarande transaktivering och kooperativiteten är normal nås platån för A/a inte vid TR = 1 utan på en lägre nivå (röd). Följaktligen korsar kurvan för A/a kurvan för A/-. Denna allel a är hypomorf om systemet normalt fungerar vid låga mättnadsnivåer av A och a, medan det är DN för högre koncentrationer. Parametrar finns i Supplemental Materials online.
Vad händer i A/a när a saknar transaktiveringsdomänen i avsaknad av kooperativitet? Enligt den klassiska DN-definitionen är kurvan lägre i varje punkt än i A/-. Det finns dock en tendens att nå mättnad med ökande koncentrationer av A och a. Faktum är att A tenderar att företrädesvis ockupera promotorn eftersom det säkerställer kooperativa interaktioner med inkommande A-monomerer. Det är dock uppenbart att promotorerkännandet vid låga proteinkoncentrationer sker mindre lätt i A/a än i vildtyptillståndet. I praktiken kommer en trunkerad monomer som inte kan säkerställa kooperativa interaktioner att leda till en svag DNE. Situationen är helt annorlunda i den andra extremen, när kooperativiteten mellan A och a upprätthålls fullt ut. Kurvans platå för A/a uppnås faktiskt vid TR = 0,25. Detta är förväntat eftersom pAA, som driver transkriptionen (dvs. bidragen från pAa och paa är försumbara), endast utgör 25 % av de ockuperade promotorsorterna vid mättnad.
Ett potentiellt exempel ges av en artificiell mutation i TF FOXL2. Denna TF reprimerar promotorn för den humana steroidogena akuta regulatoriska genen, som innehåller flera förmodade bindningsställen. En version av FOXL2 som innehåller DNA-bindningsdomänen men saknar den C-terminala domänen kan inducera en DNE som försämrar den transkriptionella repressionen. Denna effekt erhålls dock endast när DN-versionen är mycket starkare uttryckt (5× och 10×) än vildtypsproteinet (Pisarska et al., 2004). Som beskrivits ovan kan detta bero på avsaknad av kooperativa interaktioner mellan FOXL2-molekyler på denna promotor.
Ett mer talande exempel ges i figur 8, som representerar svaret från två olika promotorer som innehåller en eller två bindningsställen för TF PTX2a och dess DN-version, enligt tidigare beskrivning (Saadi et al., 2003. Vid låga mängder transfekterande DNA (0,05 μg i figur 8) är svaret från promotorn med två platser mer än två gånger starkare (dvs. 3×) än svaret från promotorn med endast en plats. Detta är den kombinerade signaturen av kooperativitet och synergi. Vid höga koncentrationer av transfekterande konstruktioner WT+DN är dessutom TR hos promotorn med två bindningsställen ∼25 % av svaret hos enbart vildtypen. Detta är förväntat eftersom dimerer vid hög proteinkoncentration kan preassembleras redan innan de når mål-DNA:t. I detta fall kommer endast 25 % av dimererna att vara normala. Nedgången i TR är mindre dramatisk för promotorn med endast en bindningsställe (förväntat 50 %). Ur praktisk synvinkel, för att undvika att förbise en potentiell DNE i in vitro-experiment, bör små mängder av WT+DN-konstruktionerna transfekteras med ett överskott av reporterpromotor för att undvika att den blir mättad av vildtypsformen. Mer allmänt bör responskurvor för olika TF-koncentrationer tillhandahållas för sådana transfektionsexperiment.
Svar från två olika artificiella promotorer (p) som innehåller en eller två bicoidliknande bindningsställen för TF PITX2a och dess DN-version (K88E).
Solida linjer: Promotoraktivitet (luciferasreportersystem) i närvaro av vildtyp-TF. Streckade linjer: samexpression av vildtypen och dess DN-version. Lägg märke till att vid låga mängder transfekterande DNA är svaret från promotorn med två platser >2 gånger starkare (dvs. 3×) än svaret från promotorn med endast en plats på grund av kooperativitet och synergi. Som förutspått är TR hos promotorn med två bindningsställen ∼25 % av svaret hos enbart vildtypen vid stora mängder konstruktioner WT+DN. Nedgången i TR är som väntat mindre dramatisk för promotorn med endast en bindningsställe. Reproducerad och modifierad med tillstånd av författarna och från Molecular and Cellular Biology and the American Society for Microbiology (Saadi et al., 2003).
Som intuitivt förväntat, när transaktiveringskapaciteten hos a är normal och kooperativitet saknas, uppträder en mycket mild DNE som leder till ett beteende som ligger nära en nollallel i ett heterozygot tillstånd. Isolering av denna typ av mutant är möjlig med hjälp av en elegant genetisk screening av jäst som beskrivs av Burz och Hanes (2001). En mutation kan påverka nivåerna av kooperativitet mindre dramatiskt. Ett intressant fall uppstår när kooperativiteten sjunker till ungefär en tiondel av den normala nivån (enligt de parametrar som ligger till grund för de resultat som presenteras i figur 7) och transaktiveringskapaciteten är normal. Under dessa förhållanden beter sig varianten a som en hypomorf allel i homozygoten a/a och som en nollallel i A/a (dvs. A/a = A/-; data visas inte). Detta belyser återigen avsaknaden av tydliga gränser mellan hypomofiska, DN- och nollalleler.
När det finns kvarvarande transaktivering (dvs. 1<Kpola<KpolA) och kooperativiteten är normal, nås platån i A/a inte vid TR = 1 utan på en lägre nivå. Alleler med partiell aktiveringskapacitet kan i vissa fall lätt produceras. Paradigmet tillhandahålls jäst TF Gal4, som innehåller två aktiverande regioner (ARI och ARII) som är involverade i rekryteringen av transkriptionsmaskineriet. Deletioner i den sura regionen ARII leder till en minskning av transaktiveringskapaciteten (Ptashne och Gann, 2002; Ptashne, 2007). En kombination av en sådan allel med Gal4 av vildtyp bör uppträda enligt beskrivningen. Som framgår av figur 7 korsar kurvan för A/a kurvan för A/-. Samma allel kan alltså vara hypomorf om systemet fungerar vid låga mättnadsnivåer (innan kurvorna korsar varandra) och kan vara DN i molekylära termer vid högre proteinkoncentrationer. En intuitiv förklaring kan ges. Tänk till exempel på ett protein a som interagerar med polymeraset med, låt säga, 90 % av vildtypens styrka. För ett intervall av koncentrationer kommer heterozygoten A/a att ha en tendens att bete sig som A/A. Vid mättnad kommer dock endast 25 % av promotorarten att vara pAA, som interagerar med polymeraset med maximal styrka. I heterozygoten A/- är det däremot vid låga proteinkoncentrationer svårare att ockupera promotorn, medan 100 % av promotorns art vid mättnad kommer att utgöras av pAA. Således måste kurvorna för A/a och A/- korsa varandra någon gång.
Alla målpromotorer inom en cell är inte lika känsliga för en DN TF. När det finns stark kooperativitet och synergi bör känsligheten hos en promotor för ett DN-protein bero på antalet bindningsställen på DNA. Det enklaste fallet att visualisera är när a saknar en transaktiveringsdomän men interagerar kooperativt med A. Om den promotorsort som driver transkriptionen är den som är fullt laddad med vildtypsprotein, vilket antas ovan, kan den maximala TR beräknas med hjälp av formeln (för binomiala sannolikheter) som ges i Supplemental Materials online. För en promotor med två identiska bindningsställen kommer den maximala TR att vara 25 % i förhållande till utgången i vildtyptillstånd: för tre bindningsställen 12,5 % och för fyra bindningsställen 6,25 % (när A och a uttrycks i ekvimolära koncentrationer). För mer komplexa situationer är svaret inte intuitivt och kräver analys av modeller som inte behandlas här.