Komponenterna i ett grundläggande system för högpresterande vätskekromatografi visas i det enkla diagrammet i figur E.
En behållare innehåller lösningsmedlet . En högtryckspump används för att generera och mäta en specificerad flödeshastighet av rörlig fas, vanligtvis milliliter per minut. En injektor kan föra in provet i den kontinuerligt flödande strömmen av rörlig fas som för in provet i HPLC-kolonnen. Kolonnen innehåller det kromatografiska packningsmaterial som behövs för att genomföra separationen. Detta packningsmaterial kallas stationär fas eftersom det hålls på plats av kolonnens hårdvara. Det behövs en detektor för att se de separerade föreningsbanden när de elueras från HPLC-kolonnen . Den rörliga fasen lämnar detektorn och kan skickas till avfallet eller samlas in. När den rörliga fasen innehåller ett band av en separerad förening ger HPLC möjlighet att samla in denna fraktion av eluatet som innehåller den renade föreningen för vidare studier. Detta kallas preparativ kromatografi.
Notera att högtrycksslangar och kopplingar används för att koppla samman pump-, injektor-, kolonn- och detektorkomponenterna så att de bildar ledningen för den rörliga fasen, provet och banden av separerade föreningar.
Figur E: Högpresterande vätskekromatografisystem
Detektorn är kopplad till datastationen, den komponent i HPLC-systemet som registrerar den elektriska signal som behövs för att generera kromatogrammet på displayen och för att identifiera och kvantifiera koncentrationen av provets beståndsdelar (se figur F). Eftersom egenskaperna hos provets beståndsdelar kan vara mycket olika har flera typer av detektorer utvecklats. Om en förening till exempel kan absorbera ultraviolett ljus används en UV-absorbansdetektor. Om föreningen fluorescerar används en fluorescensdetektor. Om föreningen inte har någon av dessa egenskaper används en mer universell typ av detektor, t.ex. en detektor för evaporativ ljusspridning . Den mest kraftfulla metoden är att använda flera detektorer i serie. Exempelvis kan en UV- och/eller ELSD-detektor användas i kombination med en masspektrometer för att analysera resultaten av den kromatografiska separationen. Detta ger, från en enda injektion, mer omfattande information om en analyt. Metoden att koppla en masspektrometer till ett HPLC-system kallas LC/MS.
Figur F: Ett typiskt HPLC-system
HPLC-drift
Ett enkelt sätt att förstå hur vi uppnår separationen av de föreningar som finns i ett prov är att titta på diagrammet i figur G.
Mobil fas kommer in i kolonnen från vänster, passerar genom partikelbädden och kommer ut till höger. Flödesriktningen representeras av gröna pilar. Betrakta först den övre bilden; den representerar kolonnen vid tiden noll , när provet kommer in i kolonnen och börjar bilda ett band. Det prov som visas här, en blandning av gula, röda och blå färgämnen, visas vid kolonnens inlopp som ett enda svart band.
Efter några minuter , under vilka den rörliga fasen flödar kontinuerligt och stadigt förbi partiklarna i packningsmaterialet, kan vi se att de enskilda färgämnena har rört sig i separata band med olika hastigheter. Detta beror på att det finns en konkurrens mellan den mobila fasen och den stationära fasen om att attrahera var och en av färgämnena eller analyterna. Lägg märke till att det gula färgämnesbandet rör sig snabbast och är på väg att lämna kolonnen. Det gula färgämnet gillar den rörliga fasen mer än de andra färgämnena. Därför rör det sig med högre hastighet, närmare den rörliga fasens hastighet. Det blå färgämnesbandet gillar förpackningsmaterialet mer än den rörliga fasen. Dess starkare attraktion till partiklarna gör att det rör sig betydligt långsammare. Med andra ord är det den förening som hålls kvar mest i denna provblandning. Det röda färgämnesbandet har en mellanliggande attraktion till den rörliga fasen och rör sig därför med en mellanliggande hastighet genom kolonnen. Eftersom varje färgämnesband rör sig med olika hastighet kan vi separera det kromatografiskt.
Figur G: Förståelse för hur en kromatografisk kolonn fungerar – band
Vad är en detektor?
När de separerade färgämnesbanden lämnar kolonnen passerar de omedelbart in i detektorn. Detektorn innehåller en flödescell som ser varje separerat band av föreningar mot en bakgrund av rörlig fas . En lämplig detektor har förmågan att känna av närvaron av en förening och sända motsvarande elektriska signal till en datastation. Ett val görs bland många olika typer av detektorer, beroende på egenskaperna och koncentrationerna hos de föreningar som måste separeras och analyseras, vilket diskuterats tidigare.
Vad är ett kromatogram?
Ett kromatogram är en representation av den separation som har skett kemiskt i HPLC-systemet. En serie toppar som stiger från en baslinje ritas på en tidsaxel. Varje topp representerar detektorsvaret för en annan förening. Kromatogrammet ritas upp av datastationen.
Figur H: Hur toppar skapas
I figur H har det gula bandet helt passerat genom detektorns flödescell; den genererade elektriska signalen har skickats till datastationen. Det resulterande kromatogrammet har börjat visas på skärmen. Observera att kromatogrammet börjar när provet först injicerades och börjar som en rak linje nära botten av skärmen. Detta kallas baslinjen och representerar den rena rörliga fasen som passerar genom flödescellen över tiden. När det gula analytbandet passerar genom flödescellen skickas en starkare signal till datorn. Linjen kröker sig, först uppåt och sedan nedåt, i proportion till koncentrationen av det gula färgämnet i provbandet. Detta skapar en topp i kromatogrammet. När det gula bandet har passerat helt och hållet ut ur detektorcellen återgår signalnivån till baslinjen; flödescellen har nu, återigen, endast ren rörlig fas i sig. Eftersom det gula bandet rör sig snabbast och eluerar först från kolonnen, är det den första topp som ritas ut.
En liten stund senare når det röda bandet flödescellen. Signalen stiger från baslinjen när det röda bandet först kommer in i cellen, och den topp som representerar det röda bandet börjar dras. I detta diagram har det röda bandet inte helt passerat genom flödescellen. Diagrammet visar hur det röda bandet och den röda toppen skulle se ut om vi stoppade processen vid detta tillfälle. Eftersom större delen av det röda bandet har passerat genom cellen har större delen av toppen dragits, vilket visas av den heldragna linjen. Om vi kunde starta på nytt skulle det röda bandet passera helt genom flödescellen och den röda toppen skulle vara färdig. Det blåa bandet, som är det mest fasthållna, rör sig långsammast och elueras efter det röda bandet. Den streckade linjen visar hur det färdiga kromatogrammet skulle se ut om vi hade låtit körningen fortsätta till slutet. Det är intressant att notera att bredden på den blå toppen kommer att vara den bredaste eftersom bredden på det blå analytebandet, som är smalast på kolonnen, blir bredast när det elueras från kolonnen. Detta beror på att den rör sig långsammare genom det kromatografiska packningsmaterialet och kräver mer tid för att elueras fullständigt. Eftersom den rörliga fasen kontinuerligt flödar med en fast hastighet innebär detta att det blå bandet breddas och blir mer utspätt. Eftersom detektorn reagerar i proportion till bandets koncentration är den blå toppen lägre i höjd, men större i bredd.