Diagnos av legionellainfektion

Abstract

Legionellae, som är viktiga orsaker till lunginflammation hos människor, fortsätter att felaktigt betecknas som exotiska patogener. Förmågan att diagnostisera Legionella-infektion begränsas av de kliniska känneteckens ospecifika karaktär och bristerna i diagnostiska tester. Trots förbättringar på senare tid saknar de befintliga diagnostiska testerna för legionellainfektion antingen känslighet för att upptäcka alla kliniskt viktiga legionella eller kan inte ge resultat inom en kliniskt användbar tidsram. Det är viktigt att förstå den lokala legionellaepidemiologin för att kunna fatta beslut om huruvida man ska testa för legionellainfektion och vilka diagnostiska tester som ska användas. I de flesta situationer är användningen av både urinantigentestet och sputumodling den bästa diagnostiska kombinationen. Polymeraskedjereaktion (PCR) är ett lovande verktyg, men standardiserade tester finns inte tillgängliga i handeln. Det fortsatta arbetet måste inriktas på utveckling av tester för urinantigen-test som påvisar ett bredare spektrum av patogena legionellae och på utveckling av standardiserade PCR-analyser.

Legionärssjuka fortsätter att ha rykte om sig att vara en exotisk infektion. Tvärtom, när man systematiskt söker efter Legionella-arter erkänns de konsekvent som en av de vanligaste orsakerna till lunginflammation. Utanför forskningsmiljön är dock bekräftade diagnoser av legionellos sällsynta. Detta misslyckande med att diagnostisera legionärssjuka i rutinmässig praxis beror till stor del på tre faktorer: oförmågan att kliniskt och radiografiskt skilja legionärssjuka från andra orsaker till lunginflammation, misslyckandet med att beställa diagnostiska tester för legionellainfektion och bristerna i tillgängliga diagnostiska tester. Legionärssjuka beskrivs mer korrekt som en svårfångad diagnos snarare än en exotisk infektion.

Trots att diagnostiska metoder har förbättrats under de 25 år som gått sedan Legionella pneumophila först beskrevs, finns det inget test som för närvarande är tillgängligt som kan diagnostisera legionärssjuka i rätt tid med en hög grad av sensitivitet och specificitet. Vissa författare har ifrågasatt rutinmässig beställning av mikrobiologiska tester för patienter med lunginflammation, med stöd av uppgifter som tyder på att sådana tester inte har någon betydande inverkan på valet av antibiotikabehandling och patientens resultat . Nyligen hävdade Marrie att detta tillvägagångssätt för att diagnostisera legionärssjuka var fel. Om man inte testar för legionellainfektion kan det fördröja upptäckten av utbrott av legionärssjuka, man kan missa förändringar i sjukdomens epidemiologi (inklusive utvecklingen av antimikrobiell resistens) och man kan hindra personer från att begära ersättning för yrkesrelaterad infektion. Av betydelse är att det är möjligt att välja ut en undergrupp av patienter för vilka avkastningen från diagnostiska tester för legionellainfektion är hög och som skulle gynnas av en specifik diagnos.

Denna genomgång fokuserar på nuvarande diagnostiska tester för legionellainfektion, med särskild tonvikt på de tester som ger en diagnos inom en tidsram som kommer att påverka den initiala infektionshanteringen. När man granskar de olika diagnostiska testerna för legionellainfektion är det viktigt att ha flera faktorer i åtanke. För det första krävs specialiserade tester för att diagnostisera legionellainfektion, och dessa måste uttryckligen begäras av klinikern. För det andra är det viktigt att förstå skillnaden mellan utförandet av ett test i ett forskningslaboratorium och vad som realistiskt kan uppnås i ett lokalt diagnostiskt laboratorium. Betydande variationer mellan laboratorier har dokumenterats när det gäller förmågan att odla legionellae , och det är troligt att detta även gäller för andra tester. För det tredje hindras tolkningen av diagnostiska testers prestanda av bristen på en lämplig ”guldstandard”. Beräknade uppgifter om sensitivitet och specificitet kommer att variera med olika jämförelsestandarder. För det fjärde påverkas användbarheten av diagnostiska tester av den lokala legionellaepidemiologin. L. pneumophila serogrupp 1 är den dominerande orsaken till legionellos i många, om inte de flesta, områden i världen, och infektion med denna organism är lättare att diagnostisera än infektion med andra Legionella-arter och serogrupper. I vissa regioner är andra arter och serogrupper viktigare. Legionella longbeachae är t.ex. en viktig orsak till legionellos i Australien och Nya Zeeland , där den ofta förknippas med exponering för krukväxtblandning . Infektion med denna art kommer inte att upptäckas med de nuvarande urinantigentesterna och kommer att missas av laboratorier som utför serologiska tester endast för L. pneumophila.

Kultur

Kulturdiagnostik kräver speciella medier, adekvat behandling av prover och teknisk expertis (tabell 1). Det krävs flera dagar för att få ett positivt resultat, och de flesta Legionellakolonier upptäcks inom 3-5 dagar. Det standardmedium som används för odling av legionella är buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar kompletterat med α-ketoglutarat, med eller utan antimikrobiella medel. Detta medium innehåller järn och L-cystein, som båda är nödvändiga för legionellas tillväxt. Tillväxten av vissa Legionella-arter (t.ex. Legionella micdadei och Legionella bozemanii) förbättras genom att BCYE-agar kompletteras med bovint serumalbumin, och tillsats av indikatorfärgämnen till medierna kan underlätta identifieringen. Kulturmedier som innehåller cefamandol hämmar tillväxten av Legionella-arter som inte producerar β-laktamas, t.ex. L. micdadei och L. bozemanii .

Legionellae kan isoleras från en mängd olika provtyper, även om sekret från de nedre luftvägarna (t.ex, sputum och bronkoskopiprover) är de vanligaste proverna. Den största begränsningen av sputumodling är att mindre än hälften av patienterna med legionärssjuka producerar sputum . Andra faktorer påverkar kulturens känslighet när ett sputumprov har tagits. Legionellabakterier kan överleva dåligt i andningssekret, och dessa prover bör behandlas snabbt. Vissa patienter med legionärssjuka producerar sputum med relativt lite purulens; dessa prover kan avvisas av laboratorier som avvisar sputumprover som innehåller få polymorfonukleära leukocyter . Följaktligen bör kriterier för avvisning inte tillämpas på sputumprover som skickas för legionellaodling. Laboratoriepersonalens erfarenhet är också viktig, och laboratorier med erfarenhet av legionellaodling har större sannolikhet att återfå organismen.

Den uppskattade känsligheten för sputumodling varierar från <10 % till ∼80 % och varierar beroende på olika jämförelsestandarder och enskilda laboratorier . I praktiken uppnås de bättre resultaten sannolikt endast av laboratorier med ett särskilt intresse för legionellainfektion, och känsligheten är vanligtvis <50 % när serologiska fynd används som standard. Bronkoskopiska prover ger sannolikt ett större diagnostiskt utbyte än expectorerade sputumprover.

Legionella-arter kan isoleras från blododlingar, men utbytet är dåligt. Tillväxt av legionellae upprätthålls av rutinmässiga blododlingsmedier men aktiverar kanske inte larmet i kommersiella blododlingsmaskiner . Följaktligen krävs blinda subkulturer på fasta medier. Totalt sett är utbytet av blododlingar lågt och det är osannolikt att det påverkar den kliniska hanteringen.

Färgning med direktfluorescerande antikroppar (Dfa)

Färgning med Dfa kan påvisa legionellae i respiratoriska sekret och vävnadsprover. Denna teknik har fördelen att den ger ett resultat inom 2-4 timmar, men den är tekniskt krävande och bör utföras av erfaren laboratoriepersonal. Den rapporterade känsligheten för DFA-färgning varierar, är konsekvent lägre än den för odling och är mindre exakt känd för andra arter än L. pneumophila. För sekret från de nedre luftvägarna varierar känsligheten i allmänhet mellan 25 % och 66 %, och prover från bronkoalveolärt lavagevätska har ett högre utbyte än transtrakeala prover eller sputumprover . Specificiteten för DFA-färgning har uppskattats till ∼94 % , även om testet sannolikt är mindre specifikt i oerfarna händer. Falskt positiva resultat kan förekomma på grund av korsreaktioner med andra bakterier, inklusive Bacteroides fragilis, Pseudomonas species, Stenotrophomonas species och Flavobacterium species. Korsreaktioner kan vara ett mindre problem när DFA-medel med monoklonala antikroppar används. Problem med känslighet och specificitet har begränsat användningen av DFA-färgning, och ett positivt DFA-resultat i avsaknad av andra stödjande bevis accepteras nu i allmänhet inte som tillräckligt för att ställa diagnosen Legionellainfektion.

Detektion av urinavfallande antigen

Detektion av lösligt Legionellaantigen i urinprov är en snabb metod som ger en tidig diagnos av Legionellainfektion och har varit ett användbart redskap för att undersöka utbrott av legionärssjuka . Kommersiella kit som använder både RIA- och EIA-metodik har funnits tillgängliga i flera år och har liknande prestanda. Nyligen har en immunokromatografisk test (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) utvecklats som har liknande känslighet och specificitet som EIA . Testet är lätt att utföra och kan ge ett resultat inom 15 minuter.

För detektion av L. pneumophila serogrupp 1 har urinantigentester en känslighet på 70-100 % och en specificitet som närmar sig 100 %. Känsligheten kan ökas med så mycket som 20 % genom en 25-faldig koncentration av urinproverna före testning . Den största nackdelen med dessa tester är deras oförmåga att på ett tillförlitligt sätt upptäcka andra organismer än L. pneumophila serogrupp 1. Test med brett spektrum som påvisar lösliga antigener från ett stort antal olika Legionella-arter har utvecklats men är inte kommersiellt tillgängliga. Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) är avsett att upptäcka andra legionellaorganismer än L. pneumophila serogrupp 1, men det är mindre tillförlitligt än vad det är när det gäller L. pneumophila serogrupp 1 . Falskt positiva resultat av urinantigen har förekommit hos patienter med serumsjuka .

Legionella antigenuri kan påvisas så tidigt som 1 dag efter symtomdebut och kvarstår i dagar till veckor. I ett fall dokumenterades att utsöndring av antigen skedde i >300 dagar . Lösliga legionellaantigen har också påvisats i andra prover än urin, inklusive prover av sputum, lungvävnad, serum och pleuravätska, även om användningen av sådana prover inte har utvärderats fullt ut.

Urinär antigentestning är nu ett etablerat och värdefullt verktyg för att diagnostisera legionärssjuka, särskilt i regioner där L. pneumophila serogrupp 1 är den vanligaste orsaken till sjukdomen. På platser där endast en minoritet av infektionerna orsakas av L. pneumophila serogrupp 1 bidrar de för närvarande tillgängliga urinantigenbestämningarna mindre till de befintliga laboratorietesterna.

Serologisk testning

Serologisk testning för legionellainfektion är ett värdefullt epidemiologiskt verktyg, men har liten inverkan på det kliniska beslutsfattandet på grund av tidsfördröjningen innan ett resultat är tillgängligt. De antikroppar som produceras som svar på infektion är i allmänhet en blandning av IgA, IgM och IgG, och testerna bör påvisa alla typer för optimal känslighet. Mätning av specifikt IgM är en opålitlig markör för akut infektion, eftersom IgM-antikroppar kan kvarstå under långa perioder. Serokonversion kan ta flera veckor, vilket är en stor begränsning av serologiska tester. I de flesta fall upptäcks en 4-faldig ökning av antikroppstitern inom 3-4 veckor, men i vissa fall kan detta ta >10 veckor . Om man tar serumprover i konvalescensfasen för tidigt kan det utan tvekan leda till många falskt negativa resultat och förklarar förmodligen delvis de 20-30 % av patienterna med legionärssjuka som förmodligen inte utvecklar ett påvisbart antikroppssvar . Det står dock klart att en del personer med bevisad legionellainfektion inte har någon påvisbar serokonversion . I praktiken bör kliniker uppmuntras att ta serumprover från konvalescensfasen tre veckor efter insjuknandet för testning parallellt med serum som tagits under den akuta fasen. Om det inte finns någon serokonversion efter denna tidsperiod och legionellainfektion fortfarande misstänks, bör ytterligare ett prov i konvalescensfasen tas.

Av de olika antikroppsdetekteringsmetoder som finns tillgängliga är indirekt immunofluorescens det standardiserade referenstestet. En 4-faldig eller större ökning av den reciproka antikroppstitern till ⩾128 anses vara diagnostisk. Reciproka antikroppstitrar i akutfasen på ⩾256 i närvaro av lunginflammation ansågs en gång i tiden vara tillräckliga för en presumtiv diagnos, men detta har visat sig vara otillförlitligt, särskilt med tanke på den höga prevalensen av positivitet för Legionella-antikroppar hos vissa personer utan kliniska tecken på legionellos. Det är praktiskt taget meningslöst att testa enskilda serumprover.

En annan nackdel med serologisk testning är oförmågan att korrekt upptäcka alla Legionella-arter och serogrupper. Även om serokonversion till L. pneumophila serogrupp 1 i allmänhet anses vara mycket förutsägande för sjukdom, har känsligheten och specificiteten för serokonversion till andra arter och serogrupper inte bekräftats strikt. Dessutom kan korsreaktiv antikroppsbildning bland medlemmar av familjen Legionellaceae göra det svårt att fastställa den infekterande arten eller serogruppen. Vissa patienter med infektion som inte tillhör L. pneumophila serogrupp 1 kommer att få serokonversion till L. pneumophila serogrupp 1 . Omvänt visar sekvensbaserad identifiering av Legionella-PCR-produkter från patienter som har haft serokonversion till andra Legionella-arter än L. pneumophila att det är troligt att vissa av dem har infekterats med L. pneumophila (opublicerade observationer). Korsreaktiva antikroppar hittas också ibland hos patienter med infektioner orsakade av andra bakterier än Legionella, inklusive pseudomonader, mykobakterier, Bacteroides-arter och Campylobacter-arter. En intressant korsreaktion förekommer mellan L. bozemanii och Rickettsia typhi till följd av ett gemensamt antigen .

Nukleinsyraförstärkning

Nyligen har DNA-detekteringstekniker visat sig lovande för snabb diagnos av Legionella-infektioner. PCR möjliggör specifik amplifiering av små mängder Legionella-DNA, ger resultat på kort tid och kan upptäcka infektioner orsakade av alla Legionella-arter och serogrupper. För närvarande är PCR för legionella endast tillgänglig i ett begränsat antal laboratorier som använder en mängd olika interna tester.

PCR har framgångsrikt använts för att detektera Legionella-DNA i en rad miljöprover och kliniska prover. Vid testning av prover från de nedre luftvägarna har PCR upprepade gånger visat sig ha en känslighet som är lika stor som eller större än odling . PCR kan faktiskt anses vara det bästa testet för patienter som producerar sputum. PCR:s roll för testning av andra provtyper är mindre klar. Legionella-DNA kan påvisas i urin-, serum- och leukocytprover från patienter med legionärssjuka med en känslighet på 30-86 % . Känsligheten för PCR ökar sannolikt när man testar prover som erhålls tidigt i sjukdomsförloppet och när man testar >1 provtyp från varje patient . Halssvabbar kan också vara ett lämpligt prov för PCR-testning, men denna tillämpning har endast utvärderats i en enda studie.

Det krävs ytterligare arbete för att fastställa en standardiserad PCR-metod som är tillräckligt robust för att kunna användas utanför ett forskningslaboratorium. Tillämpningen på icke-respiratoriska prover är särskilt attraktiv, eftersom detta kommer att kringgå problemet med patienter som inte producerar sputumprover. Utvecklingen av en optimal PCR-analys har försvårats av att vissa kommersiella DNA-extraktionssatser ibland är kontaminerade med Legionella-DNA . Användning av dessa kit för att bearbeta prover kan resultera i falskt positiva resultat och understryker vikten av att inkludera lämpliga kontroller i varje testkörning.

Teststrategi

Om legionärssjuka inte kan särskiljas kliniskt eller radiografiskt från andra orsaker till lunginflammation, kan beslutet att testa för legionellainfektion vara svårt och fattas ofta på felaktiga grunder. Det är viktigt att känna till den lokala epidemiologin. Vissa laboratorier i områden där Legionella-arter är en vanlig orsak till lunginflammation har valt att rutinmässigt odla alla sputumprover från patienter med lunginflammation på Legionella-medier. Få laboratorier skulle dock kunna motivera den extra kostnad som är förknippad med rutinmässig legionellaodling. På de flesta platser är incidensen av legionellainfektion okänd, och beslutet att beställa diagnostiska tester för legionellainfektion är vanligtvis begränsat till riskpatienter, patienter med allvarlig lunginflammation och utbrottsscenarier. Det är säkert möjligt att välja ut en undergrupp av patienter för vilka det är troligt att resultatet av diagnostiska tester för Legionella kommer att vara relativt högt. I denna grupp ingår äldre personer, rökare, immunsupprimerade personer, personer med kroniska lungsjukdomar, patienter som bor på sjukhus med legionellakoloniserade vattentäkter och personer som exponerats för pottblandning. Incidensen av legionärssjuka är högre bland patienter med allvarlig lunginflammation, och alla patienter med lunginflammation som läggs in på en intensivvårdsavdelning bör testas för denna infektion.

På platser där L. pneumophila serogrupp 1 är den dominerande orsaken till Legionella-infektion, eller under ett utbrott av infektion med L. pneumophila serogrupp 1, är urinantigentestet ett särskilt värdefullt diagnostiskt verktyg. Utvecklingen av ett kommersiellt urinantigentest som också på ett tillförlitligt sätt upptäcker andra humana Legionellapatogener skulle vara ett stort framsteg och skulle troligen göra detta test till det diagnostiska testet i nästan alla miljöer. På geografiska platser där andra legionella än L. pneumophila serogrupp 1 är numeriskt viktiga patogener, är de nuvarande urinantigentesterna fortfarande användbara men bör inte användas som enda diagnostiska verktyg. Om det finns tillgängligt är Legionella PCR i kombination med urinantigentest sannolikt den bästa initiala teststrategin som upptäcker alla Legionella-arter och ger resultat inom en tidsram som påverkar den kliniska hanteringen.

Om PCR inte finns tillgängligt är urinantigentestet i kombination med odling av prover från de nedre luftvägarna den bästa testkombinationen. Odling förblir ett viktigt diagnostiskt verktyg, men dess relativt låga känslighet och beroendet av att det finns ett prov från nedre luftvägarna gör det otillräckligt som enda diagnostiskt test. Även om serologisk testning inte har någon inverkan på den initiala behandlingen kan den vara användbar om en specifik diagnos inte kan ställas under den akuta infektionsfasen, men både prover från den akuta fasen och från konvalescensfasen måste testas parallellt. Vid ett misstänkt utbrott av legionärssjuka är ett aggressivt tillvägagångssätt för diagnostik motiverat, vilket skulle innebära användning av en kombination av testmetoder.

Legionella-arter kan ibland orsaka Pontiac-feber, en akut, febril, icke-pneumonisk sjukdom som kännetecknas av en hög angreppsfrekvens, kort inkubationstid och snabb återhämtning. Diagnosen av Pontiac-feber bygger vanligen på att man känner igen typiska kliniska drag under en utbrottssituation, och diagnosen bekräftas genom serologisk testning av drabbade personer. Användningen av odling är i stort sett begränsad till att testa miljöprover för att fastställa källan till utbrottet, även om L. pneumophila serogrupp 1 har isolerats från ett luftrörsaspirat från ett barn med Pontiac-feber .

Slutsatser

Legionella-infektion är otvivelaktigt underkänd. Diagnosen bygger på användningen av specialiserade tester, ofta i kombination. Urinantigentest, sputumodling och PCR-testning av prover från nedre luftvägarna är de viktigaste diagnostiska verktygen för att upptäcka legionellainfektion tidigt i sjukdomsförloppet. Utvecklingen av urinantigentest som påvisar ett bredare spektrum av patogena legionellae och utvecklingen av standardiserade PCR-analyser kommer att vara viktiga framsteg inom legionelladiagnostiken. Den ökade tillgängligheten och användningen av förbättrade diagnostiska tester kommer att bidra till att bättre karaktärisera epidemiologin för legionärssjuka, inklusive den verkliga incidensen och den geografiska variationen.

Acknowledgments

Jag är tacksam mot Steve Chambers för hjälpsamma kommentarer till artikeln i manuskriptet.