Oxigenul (O2) este dezvoltat în timpul transportului fotosintetic de electroni atunci când apa este scindată de complexul de transformare a oxigenului pentru a furniza protoni și electroni lanțului electronic cloroplastic, generând astfel ATP și NADPH – sursa de energie și puterea de reducere pentru metabolismul plantelor. Cea mai mare parte a acestei energii chimice este utilizată pentru a conduce metabolismul fotosintetic al carbonului, care constă în carboxilarea riboulozei-1,5-bisfosfat (ciclul de reducere a carbonului fotosintetic) și oxigenarea (ciclul de oxidare a carbonului fotosintetic); cu un necesar combinat de electroni = JA. Patru electroni sunt necesari pentru fiecare O2 dezvoltat, astfel încât producția brută de O2 (GOP) este legată de transportul liniar de electroni (J) în conformitate cu J/4. Atunci când transportul liniar de electroni este utilizat numai pentru a conduce fixarea CO2, consumul de O2 și eliberarea de CO2 prin oxidarea fotosintetică a carbonului și prin respirația mitocondrială sunt astfel încât producția netă de O2 (NOP) este egală cu asimilarea netă de CO2 (Anet; cu condiția ca coeficientul respirator să fie 1, dar a se vedea Tcherkez et al, 2017).
În plus, electronii pot fi utilizați pentru transportul alternativ neciclic de electroni (ANCET), inclusiv, de exemplu, fotoreducerea O2 însuși formând specii reactive de oxigen (reacții Mehler-peroxidază sau „ciclul apă-apă”; Asada, 1999), anabolismul cloroplastic (de exemplu, lipide; Stumpf et al, 1963), reducerea oxaloacetatului în malat (care este exportat în mitocondrii; Scheibe, 2004) și asimilarea azotului (Bloom et al., 1989). S-a emis ipoteza că ANCET este atât o modalitate de reglare a raportului ATP/NADPH pentru a satisface cerințele energetice schimbătoare ale metabolismului celular, cât și un mecanism de prevenire a fotodeteriorării prin utilizarea excesului de reductant atunci când densitatea fluxului de fotoni depășește necesarul de energie pentru fixarea CO2 (de exemplu, în condiții de iradiere ridicată, temperaturi scăzute, stres hidric care închide stomatele; de exemplu, Badger, 1985; Ort și Baker, 2002; Robinson, 1988). Este important de menționat că nu există dovezi formale privind modul în care interacționează fluxurile de electroni, în special în condiții de lumină fluctuantă (Morales et al., 2018).
Cum ANCET permite susținerea unor rate mai mari de transport liniar de electroni, transportul total de electroni (Jt) va fi mai mare decât JA. În schimb, efectul asupra absorbției de O2 va depinde de calea metabolică implicată. De exemplu, în reacțiile Mehler-peroxidază, nu există o schimbare netă în O2, astfel încât NOP va rămâne egal cu Anet. Dar în reducerea nitratului, raportul dintre producția de O2 legat de N și consumul de O2 depinde foarte mult de aminoacidul sintetizat (Noctor și Foyer, 1998). În acest caz, NOP nu va fi întotdeauna egal cu Anet, deoarece O2 și CO2 pot să nu fie echilibrate în metabolism (Skillman, 2008). În consecință, măsurătorile concomitente ale fluxurilor de CO2 și O2 sunt importante pentru înțelegerea modului în care plantele reglează utilizarea energiei luminoase, sorții diferiți având rezultate metabolice foarte diferite.
Primele măsurători ale evoluției O2 nu au fost capabile să distingă GOP de absorbția de O2 (Hill, 1937). Metoda de spectrometrie de masă stabilită de Mehler și Brown (1952) a rezolvat această problemă prin utilizarea trasorilor izotopici de O2 pentru a monitoriza independent fluxurile de 16O2 și 18O2. În această metodă, 18O2 pur a fost furnizat în spațiul de cap de gaz al unei camere închise, iar scăderea cantității de 18O2 a fost atribuită absorbției de O2. O2 evoluat are aceeași compoziție izotopică ca și apa din care este generat; în acest caz, izotopul dominant în apă a fost 16O (Fig. 1). Abordarea de marcare cu 18O a fost aplicată ulterior la discuri de frunze (de exemplu, Tourneux și Peltier, 1995), frunze întregi extirpate (de exemplu, Volk și Jackson, 1972) și plante întregi (Gerbaud și André, 1980), luminând soarta O2 in vivo.
Reprezentare simplă a reacțiilor care pot fi implicate în producerea și absorbția brută de O2 de către o celulă fotosintetizantă, arătând modul în care apa 18O marcată duce la producerea de 18O2 în abordarea dezvoltată de Gauthier et al. (2018). În cazul reacțiilor din cadrul peroxizomului și mitocondriilor, acest lucru reprezintă doar consumul net de O2, adică are loc atât absorbție, cât și eliberare. PSII, fotosistemul II; PSI, fotosistemul I; Fd, ferredoxina; M, reacția Mehler; PCR; reducerea carbonului fotosintetic; PCO, oxidarea carbonului fotosintetic; PGA, 3-fosfoglicerat; P-Glyc, fosfoglicolat; Glyox, glioxilat; OAA, oxaloacetat; Mal, malat.
Limitarea sistemelor închise de schimb de gaze este că măsurătorile pot fi efectuate doar pentru perioade scurte de timp (secunde până la minute) înainte ca concentrația de CO2 să se epuizeze. În consecință, raportul CO2:O2 nu este constant, ceea ce modifică ratele relative de carboxilare și oxigenare, astfel încât estimările privind absorbția de GOP și O2 vor fi inexacte. Această limitare a fost depășită în abordarea prin spectrometrie de masă prin înlocuirea CO2 consumat prin influxul periodic de CO2 în cameră, permițând o cuantificare în stare de echilibru și extinzând capacitatea de a măsura fluxurile de O2 într-o gamă de condiții și stări fiziologice (Canvin et al., 1980). În același timp, se făceau progrese în utilizarea fluorescenței clorofilei, care oferă informații despre randamentul cuantic al PSII (Baker, 2008). Genty et al. (1989) au furnizat legătura empirică între fluorescență și rata de transport al electronilor, înlocuind necesitatea de a măsura direct evoluția O2. Fluorescența clorofilei este în prezent una dintre cele mai populare tehnici în fiziologia plantelor, datorită ușurinței de utilizare și costului relativ scăzut. Acest lucru a fost favorizat de capacitatea de a multiplexa măsurătorile de fluorescență cu schimbul de gaze H2O și CO2 în instrumente portabile, disponibile în comerț, deschizând posibilitatea de a măsura funcția plantelor în afara laboratorului. În consecință, măsurătorile in vivo ale fluxurilor de O2 au scăzut substanțial în ultimii 20 de ani.
În acest număr din Plant Physiology, Gauthier et al. (2018) ne reamintesc de ce este atât de important să ne întoarcem atenția asupra O2, oferindu-ne un sistem nou și elegant de măsurare a fluxurilor de O2 pe cale deschisă. Metoda lor este o abordare izotopică „inversă”, care implică marcarea cu 18O a apei din frunze mai degrabă decât a aerului, astfel încât compoziția izotopică a O2 care evoluează în timpul scindării apei are o semnătură foarte diferită de cea a O2 din mediul ambiant (Fig. 1). Utilizarea unei îmbogățiri considerabile în 18O este imperativă, deoarece contribuția NOP într-un fond de 21% O2 este probabil să fie de ordinul a 0,05% (de exemplu, 100 μmol mol-1 NOP/210.000 μmol mol-1 O2 ambiant), ceea ce face dificilă, în mod normal, detectarea cu precizie a unei modificări în δ18O a O2 asociat cu NOP în aerul din jurul frunzei.
Metoda rămâne foarte tehnică, necesitând utilizarea a trei instrumente de înaltă precizie. Compoziția izotopică și concentrația vaporilor de CO2 și H2O sunt măsurate prin spectroscopie laser, iar δ18O2 și δO2/N2 (pentru a estima concentrația de O2) prin spectrometrie de masă. De asemenea, este necesară o cameră personalizată pentru a găzdui frunza extirpată și sursa de apă marcată cu 18O, ceea ce ajută la prevenirea scurgerilor prin garniturile din jurul pețiolului. În mod important, sistemul deschis de schimb de gaze îmbunătățește capacitatea de a realiza măsurători în regim staționar, iar etichetarea apei față de utilizarea gazului 18O2 pur rezolvă problema accesibilității, care a limitat foarte mult adoptarea sistemelor deschise.
În timp ce fluorescența clorofilei a devenit opțiunea populară pentru măsurarea vitezei de transport al electronilor, aceasta nu este lipsită de ipoteze. De exemplu, se presupune frecvent că frunzele absorb 84% din fotonii incidenți și că 50% din acești fotoni sunt absorbiți de PSII; cu toate acestea, este posibil ca acest lucru să nu fie întotdeauna cazul (Baker, 2008). Acest lucru poate duce la o supraestimare a ratei de transport al electronilor atunci când este calculată pe baza fluorescenței în comparație cu măsurătorile de GOP. În plus, determinarea exactă a JA este deosebit de relevantă pentru estimarea conductanței mezofilei, care a fost una dintre aplicațiile evidențiate de Gauthier et al. (2018). Reacțiile Mehler-peroxidază, care s-au dovedit a fi cuprinse între 0 % și 30 % (Driever și Baker, 2011), ar duce la o supraestimare a fluxurilor de electroni asociate cu ciclurile de reducere/oxigenare a carbonului fotosintetic în ambele metode. Cu toate acestea, avantajul abordării de etichetare izotopică este că se poate cuantifica contribuția reacției Mehler la producția brută de O2 prin cuplarea măsurătorilor de GOP cu NOP (de exemplu, Furbank et al., 1982; a se vedea Fig. 1). Acum că avem o capacitate reînnoită de a măsura fluxurile de O2, aceste ipoteze nu ar trebui să fie ignorate.
În afară de înțelegerea compromisului dintre eficiență și fotoprotecție pentru îmbunătățirea producției agricole (Murchie și Niyogi, 2011), diferitele sorturi de electroni au implicații importante pentru înțelegerea fluxurilor globale de O2. În special, absorbția de O2 asociată cu fotorespirația, respirația mitocondrială și reacțiile Mehler-peroxidază au factori de fracționare izotopică diferiți (Guy et al., 1993), astfel încât este necesară cuantificarea fluxurilor individuale ale căilor individuale pentru a constrânge estimările producției primare globale din informațiile δ18O (Welp et al., 2011).
Este timpul să revizuim măsurarea fluxurilor de O2, iar noua metodă dezvoltată de Gauthier et al. (2018) ne oferă capacitatea necesară pentru a face acest lucru.
.