PMC

DNEs ÎN REGLEMENTAREA TRANSCRIPȚIONALĂ

DNEs pot apărea, de asemenea, în contextul reglării transcripționale. De exemplu, un DNE poate fi obținut prin îndepărtarea domeniului de transactivare al unui TF modular, lăsând doar domeniul de legare a ADN-ului. Acest factor trunchiat se poate comporta ca un inhibitor competitiv al transcripției. Se știe că acest lucru se întâmplă în natură. De exemplu, proteina C/EBP la mamifere este exprimată sub forma a trei polipeptide alternative. Polipeptidele mai lungi conțin un domeniu de activare transcripțională N-terminal, în timp ce forma scurtă este lipsită de acesta. Deoarece izoformele lungi și scurte se asamblează în homo- și heterodimeri, aceasta din urmă se comportă ca un DN natural (Zahnow et al., 1997). Acesta este, de asemenea, cazul Stats 5 și 6 la vertebrate, care sunt capabile să se dimerizeze. Prelucrarea lor proteolitică ca răspuns la semnalele fiziologice duce la îndepărtarea domeniului de activare C-terminal și le transformă în inhibitori puternici care reglează negativ transducția semnalului (Nakajima et al., 2003). La plante, un număr mare de proteine MYB funcționează ca regulatori transcripționali. La Arabidopsis, proteinele care conțin o singură repetiție de legare a ADN-ului MYB, dar nu au domeniul de transactivare, sunt implicate în specificarea aspectelor legate de soarta celulelor epidermice. Aceste proteine interacționează cu alte TF-uri, inclusiv cu proteinele bHLH și, datorită absenței unui domeniu de transactivare, se comportă ca DN și trans-DN-uri prin formarea de complexe inactive (Ramsay și Glover, 2005).

Îndepărtarea domeniului de legare a ADN-ului poate duce, de asemenea, la DNE-uri. Acest lucru se întâmplă în cazul TF-urilor bHLH. După cum s-a menționat mai sus, gena Id-1 codifică un inhibitor DN care apare în mod natural al acestei familii de TF-uri. Proteinele bHLH complete (cu domenii de legare la ADN și de dimerizare) pot fi exprimate constitutiv. Cu toate acestea, expresia reglementată a Id-1, care conține doar domeniul de dimerizare, impune o reglementare a activității proteinelor bHLH (Sun, 1994). Un fenomen similar este de așteptat și la plante. De exemplu, genomul Arabidopsis codifică ∼120 de proteine bHLH despre care se preconizează că se leagă de ADN și 27 de proteine cu o regiune mai puțin bazică decât cea necesară pentru legare (Toledo-Ortiz et al., 2003). Aceste HLH-uri care nu se leagă de ADN pot funcționa ca și proteinele Id de la animale, ca regulatori negativi ai proteinelor bHLH prin formarea de heterodimeri incapabili să lege ADN (Toledo-Ortiz et al., 2003). Efecte similare sunt așteptate în cazul TF-urilor aparținând familiei bZIP (basic domain/leucine zipper), care conțin un motiv de bază de legare la ADN, un domeniu de dimerizare leucine zipper și domenii pentru transactivare. Arabidopsis codifică 67 de proteine bZIP, toate acestea fiind prezise să funcționeze ca homo- și/sau heterodimeri (Deppmann et al., 2004). Unele dintre acestea sunt foarte mici și este posibil să nu aibă domenii de activare. Într-un exemplu clasic la plante, Fukazawa et al. (2000) au elucidat funcția TF bZIP REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) în semnalizarea giberelinei prin utilizarea unei forme DN a RSG, care nu avea un domeniu de activare transcripțională și, prin urmare, a acționat pentru a reprima funcția proteinei de tip sălbatic atunci când a fost exprimată în tutunul transgenic. Mai mult, în conformitate cu ceea ce s-a spus în secțiunea care tratează trans-DN-urile prin supraexprimare, complexele de transcripție ADN-proteine sunt, de asemenea, sensibile la echilibrul dozării genelor (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Alterarea acestui echilibru prin scăderea sau creșterea expresiei unui TF în raport cu altele implicate în același complex poate induce fenotipuri anormale.

Un model simplu de activare transcripțională poate fi utilizat pentru a explora unele subtilități cantitative ale mutațiilor DN în acest context. Studiile sistemelor virale și ale Drosophilei au arătat că transcripția prezintă adesea o relație sigmoidală în raport cu concentrația unui TF. În cazul unui sistem care răspunde la un singur tip de activator (A), acest răspuns sigmoidal poate fi disecat în două componente principale: legarea cooperantă a lui A la promotorul (p) unei gene țintă și sinergia (figura 6). Sinergia este rezultatul interacțiunilor concertate dintre moleculele de A deja legate de promotor și mașinăria de transcripție (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Considerați un promotor, p, care conține două situsuri de legare pentru A. Aceleași situsuri de legare sunt recunoscute și de varianta a, care ar putea acționa ca un inhibitor competitiv. Presupunem că poate exista cooperativitate în timpul interacțiunii dintre moleculele A cu promotorul. Acest lucru ar putea fi valabil și pentru interacțiunile dintre A, a și promotor. O posibilă sursă de cooperativitate a fost menționată mai sus (de exemplu, A tinde să formeze dimeri în soluție, dar acest lucru este sporit în timpul legării la ADN). O altă posibilitate este aceea că monomerii nu pot interacționa în soluție și că interacțiunea unui monomer cu ADN-ul duce la o modificare alosterică care crește afinitatea lui A legat pentru un monomer care intră. De asemenea, este posibil, deși mai puțin probabil, că nu există interacțiuni A-A și că legarea unui monomer la ADN duce la o modificare în situsul vecin care crește afinitatea acestuia pentru un monomer nou-venit. Oricare ar fi cazul, cooperativitatea înseamnă că reacția pA + A = pAA are loc mai ușor decât p + A = pA.

Datorită existenței sinergiei, specia moleculară care contribuie cel mai mult la transcripție este promotorul ocupat de două molecule de activator: pAA. Aceasta înseamnă, de asemenea, că dacă constanta de afinitate pentru asocierea dintre complexul pA și polimerază este KpolA, K pentru asocierea dintre pAA și polimerază va fi mult mai mare decât 2K (de ordinul lui K2polA; vezi Zlotnick, 1994). Pentru a acomoda activitatea de transactivare parțială în acest model, vom folosi Kpola (pentru reacția pa + pol) și Kpola2 (pentru paa + pol). În aceste ipoteze, se poate obține o ecuație pentru răspunsul transcripțional (TR) în funcție de concentrația de A (și a), așa cum este descrisă de Veitia (2003) și Veitia și Nijhout (2006) (a se vedea Materiale suplimentare online).

Cu o ecuație destul de simplă în mână, pot fi explorate mai multe condiții: (1) situația de tip sălbatic A/A, (2) când există o alelă lipsă (A/-) și (3) când există coexpresia lui A și a unei versiuni trunchiate a căreia îi lipsește domeniul de transactivare. În acest din urmă caz, putem distinge două situații diferite: (3a) când mutația lui a abolește cooperativitatea sau (3b) când A și a interacționează cooperativ. În cele din urmă, putem explora, de asemenea, o situație (4) în care capacitatea de transactivare a lui a este normală și cooperativitatea absentă și (5) când cooperativitatea este normală, dar capacitatea de transactivare este parțială.

Figura 7 arată că a TR, în raport cu ieșirea maximă a promotorului față de prezintă o relație sigmoidală, cuprinsă între 0 și 1. Saturația reflectă răspunsul maxim al sistemului, dar acest lucru nu implică faptul că promotorul funcționează numai la saturație. Conform figurii, și în general, valorile de pe curbă pentru heterozigotul A/- în orice punct sunt mai mici decât la A/A (pentru fiecare valoare a relației , heterozigotul A/- are de două ori mai puțin în termeni absoluți decât tipul sălbatic). Este interesant faptul că, la concentrații relative scăzute de A, deplasarea dintre curbe este foarte pronunțată Y(A/-) este ∼25% din Y(A/A). Cu toate acestea, așa cum era de așteptat în mod intuitiv, pentru valori ridicate ale lui A, saturația este, de asemenea, atinsă în A/-. Dacă acest sistem ar fi funcțional în mod normal la concentrații scăzute de A, un individ A/- ar prezenta un fenotip tipic haploinsuficient.

Ce se întâmplă la A/a atunci când lui a îi lipsește domeniul de transactivare în absența cooperativității? Conform definiției clasice a DN, curba este mai mică în orice punct decât cea din A/-. Cu toate acestea, există o tendință de a ajunge la saturație odată cu creșterea concentrațiilor de A și a. De fapt, A tinde să ocupe preferențial promotorul, deoarece asigură interacțiuni cooperative cu monomerii A care sosesc. Cu toate acestea, este evident că recunoașterea promotorului la o concentrație scăzută de proteină are loc mai puțin ușor în A/a decât în condiția de tip sălbatic. În practică, un monomer trunchiat incapabil să asigure interacțiuni cooperative va conduce la un DNE slab. Situația este complet diferită la cealaltă extremă, atunci când cooperativitatea dintre A și a este menținută în totalitate. Într-adevăr, platoul curbei pentru A/a este atins la TR = 0,25. Acest lucru este de așteptat deoarece pAA, care conduce transcripția (adică, contribuțiile pAa și paa sunt neglijabile), reprezintă doar 25% din speciile de promotori ocupate la saturație.

Un exemplu potențial este oferit de o mutație artificială în TF FOXL2. Acest TF reprimă promotorul genei de reglementare acută steroidogenă umană, care conține mai multe situsuri de legare putative. O versiune a FOXL2 care conține domeniul de legare a ADN-ului, dar este lipsită de domeniul C-terminal, este capabilă să inducă un DNE care afectează represiunea transcripțională. Cu toate acestea, acest efect este obținut numai atunci când versiunea DN este mult mai puternic exprimată (5× și 10×) decât proteina de tip sălbatic (Pisarska et al., 2004). Așa cum s-a subliniat mai sus, acest lucru se poate datora absenței interacțiunilor cooperative între moleculele FOXL2 pe acest promotor.

Un exemplu mai elocvent este oferit în figura 8, care reprezintă răspunsul a doi promotori diferiți care conțin unul sau două situsuri de legare pentru TF PTX2a și versiunea sa DN, așa cum a fost descris anterior (Saadi et al., 2003. La cantități mici de ADN transfectant (0,05 μg în figura 8), răspunsul promotorului cu două situsuri este de peste două ori mai puternic (adică 3×) decât răspunsul promotorului cu un singur situs. Aceasta este semnătura combinată a cooperativității și sinergiei. Mai mult, la concentrații ridicate de transfectare a construcțiilor WT+DN, TR al promotorului cu două situsuri de legare este ∼25% din răspunsul tipului sălbatic singur. Acest lucru este de așteptat deoarece, la o concentrație mare de proteine, dimerii pot fi preasamblați chiar înainte de a ajunge la ADN-ul țintă. În acest caz, doar 25% din dimeri vor fi normali. Scăderea TR este mai puțin dramatică pentru promotorul cu un singur situs de legare (50% așteptat). Din punct de vedere practic, pentru a evita trecerea cu vederea a unui potențial DNE în experimentele in vitro, cantități mici de construcții WT+DN ar trebui să fie transfectate cu un exces de promotor reporter pentru a evita saturarea acestuia de către forma de tip sălbatic. Mai general, ar trebui furnizate curbe de răspuns pentru diferite concentrații de TF pentru astfel de experimente de transfecție.

După cum era de așteptat în mod intuitiv, atunci când capacitatea de transactivare a a este normală și cooperativitatea absentă, apare o DNE foarte ușoară care duce la un comportament apropiat de o alelă nulă în stare heterozigotă. Izolarea acestui tip de mutant este posibilă cu ajutorul unui ecran genetic elegant de drojdie descris de Burz și Hanes (2001). O mutație poate afecta nivelurile de cooperativitate în mod mai puțin dramatic. Un caz interesant apare atunci când cooperativitatea scade la aproximativ o zecime din nivelul normal (în conformitate cu parametrii care stau la baza rezultatelor prezentate în figura 7), iar capacitatea de transactivare este normală. În aceste condiții, varianta a se comportă ca o alelă hipomorfă în homozigotul a/a și ca o alelă nulă în A/a (de exemplu, A/a = A/-; datele nu sunt prezentate). Acest lucru evidențiază din nou lipsa unor limite distincte între alelele hipomorfe, DN și nul.

Când există o transactivare reziduală (adică 1<Kpola<KpolA) și cooperativitatea este normală, platoul în A/a nu este atins la TR = 1, ci la un nivel mai scăzut. Alelele cu capacitate de activare parțială pot fi produse cu ușurință în unele cazuri. Paradigma este oferită de TF Gal4 din drojdie, care conține două regiuni de activare (ARI și ARII) implicate în recrutarea mașinăriei transcripționale. Delețiile în regiunea acidă ARII duc la o scădere a capacității de transactivare (Ptashne și Gann, 2002; Ptashne, 2007). O combinație a unei astfel de alele cu Gal4 de tip sălbatic ar trebui să se comporte așa cum este descris. După cum se arată în figura 7, curba pentru A/a o încrucișează pe cea a A/-. Astfel, aceeași alelă poate fi hipomorfă dacă sistemul funcționează la niveluri scăzute de saturație (înainte ca curbele să se intersecteze) și poate fi DN în termeni moleculari la concentrații mai mari de proteine. Se poate oferi o explicație intuitivă. Luați în considerare, de exemplu, o proteină a care interacționează cu polimeraza cu, să zicem, 90% din puterea de tip sălbatic. Pentru o gamă de concentrații, heterozigotul A/a va avea tendința de a se comporta ca A/A. Cu toate acestea, la saturație, doar 25% din specia promotoare va fi pAA, care interacționează cu polimeraza cu putere maximă. În schimb, în cazul unui heterozigot A/-, la concentrații scăzute de proteine este mai dificil de ocupat promotorul, în timp ce la saturație 100% din speciile de promotori vor fi pAA. Astfel, curbele pentru A/a și A/- trebuie să se intersecteze la un moment dat.

Toți promotorii țintă dintr-o celulă nu sunt la fel de sensibili la un TF DN. Atunci când există o puternică cooperativitate și sinergie, sensibilitatea unui promotor la o proteină DN ar trebui să depindă de numărul de situsuri de legare de pe ADN. Cel mai simplu caz de vizualizat este atunci când a este lipsit de un domeniu de transactivare, dar interacționează în mod cooperativ cu A. Dacă specia de promotor care conduce transcripția este cea complet încărcată cu proteina de tip sălbatic, așa cum s-a presupus mai sus, TR maxim poate fi calculat cu ajutorul formulei (a probabilităților binomiale) prezentate în Materiale suplimentare online. Pentru un promotor cu două situsuri de legare identice, TR maxim va fi de 25 % în raport cu producția în condiții de tip sălbatic: pentru trei situsuri de legare, 12,5 %, iar pentru patru situsuri de legare, 6,25 % (atunci când A și a sunt exprimate la concentrații echimolare). Pentru situații mai complexe, răspunsul nu este intuitiv și necesită analiza unor modele care nu sunt abordate aici.

.