Laboratorul Berg

Acest ghid este adaptat din Programul de biologie generală pentru profesorii de științe al Departamentului de biochimie și biofizică moleculară al Universității din Arizona: Drosophila Melanogaster and Mendelian Genetics, de Pete Geiger.

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster este o muscă mică, comună, care se găsește în apropierea fructelor necoapte și a fructelor putrezite. A fost folosită de peste un secol pentru a studia genetica și comportamentul. Thomas Hunt Morgan a fost cel mai important biolog care a studiat Drosophila la începutul anilor 1900. El a fost primul care a descoperit legătura de sex și recombinarea genetică, ceea ce a plasat mica muscă în fruntea cercetării genetice. Datorită dimensiunilor sale mici, ușurinței de cultivare și timpului scurt de generare, geneticienii au folosit Drosophila încă de atunci.

Muștele de fructe sunt ușor de obținut din sălbăticie și multe companii de științe biologice poartă o varietate de mutații diferite. În plus, aceste companii vând orice echipament necesar pentru a cultiva muștele. Costurile sunt relativ scăzute și majoritatea echipamentelor pot fi utilizate an de an. Există o varietate de exerciții de laborator pe care cineva le-ar putea achiziționa, deși necesitatea de a face acest lucru este discutabilă.

De ce să folosim Drosophila?

Profesorii ar trebui să folosească muște de fructe pentru studiile genetice din liceu din mai multe motive:
1. Sunt mici și ușor de manevrat.
2. Pot fi ușor anesteziate și manipulate individual cu echipamente puțin sofisticate.
3. Sunt dimorfice sexual (masculii și femelele sunt diferiți), ceea ce face ca diferențierea sexelor să fie destul de ușoară.
4. Muștele de fructe virgine sunt distincte din punct de vedere fizic de adulții maturi, ceea ce facilitează obținerea de masculi și femele virgine pentru încrucișări genetice.
5. Muștele au un timp de generare scurt (10-12 zile) și se descurcă bine la temperatura camerei.
6. Îngrijirea și cultivarea muștelor de fructe necesită puțin echipament, are un cost redus și folosește puțin spațiu chiar și pentru culturi mari.

Prin utilizarea Drosophilei, elevii vor:
1. Înțeleagă genetica mendeliană și moștenirea trăsăturilor
2. Să tragă concluzii privind modelele de ereditate din datele obținute
3. Să construiască capcane pentru a captura populații sălbatice de D. melanogaster
4. Să dobândească o înțelegere a ciclului de viață al D. melanogaster, o insectă care prezintă o metamorfoză completă
5. Să construiască încrucișări între muștele capturate și muștele cunoscute de tip sălbatic și mutate
6. Să învețe tehnici de manipulare a muștelor, de sexare a acestora și să țină notițe concise în jurnal
7. Să învețe tehnici de cultivare pentru a menține muștele sănătoase
8. Să realizeze că multe experimente științifice nu pot fi realizate și încheiate în una sau două sesiuni de laborator

Standarde naționale acoperite în aceste lecții:
Contenit:
1. Organismele au nevoie de un set de instrucțiuni pentru specificarea trăsăturilor (ereditate)
2. Informația ereditară este localizată în gene.
3. Combinațiile de trăsături pot descrie caracteristicile unui organism.

Obiectivele elevilor:
1. Să identifice întrebări și concepte care ghidează investigațiile științifice
2. Să proiecteze și să efectueze investigații științifice
3. Să formuleze și să revizuiască explicații și modele științifice folosind logica și dovezile
4. Să comunice și să susțină un argument științific

Genetica Drosophilei este bine documentată și mai multe site-uri web de domeniu public prezintă genomul complet adnotat. Prin urmare, acei profesori sau elevi care doresc să vadă unde apar mutațiile lor au la dispoziție o referință imediată.

Din moment ce Drosophila a fost atât de mult utilizată în genetică, există multe tipuri diferite de mutații disponibile pentru cumpărare. În plus, studentul atent poate găsi mutații în cadrul propriilor culturi capturate în sălbăticie, deoarece, datorită timpului scurt de generație, mutațiile sunt relativ frecvente în comparație cu alte specii de animale.
Clasificare
Domeniu: Eukarya
Regatul: Animalia
Filum: Arthropoda
Clasa: Insecta
Ordine: Diptera
Familie: Drosophilidae
Genul: Drosophila („iubitor de rouă”)
Specie: Melanogaster („intestin întunecat”)
Ciclul de viață al Drosophilei melanogaster
Drosophila melanogaster prezintă un metamorfism complet, ceea ce înseamnă că ciclul de viață include un ou, o formă larvară (asemănătoare unui vierme), pupa și, în final, apariția (eclosia) ca adult zburător. Acest lucru este identic cu bine-cunoscuta metamorfoză a fluturilor. Stadiul larvar are trei stadii, sau mutații.

Ziua 0: Femela depune ouăle
Ziua 1: Ouăle eclozează
Ziua 2: Primul stadiu (o zi în lungime)
Ziua 3: Al doilea stadiu (o zi în lungime)
Ziua 5: Al treilea și ultimul stadiu (două zile în lungime)
Ziua 7: Larvele încep stadiul de roaming. Puparierea (formarea pupei) are loc la 120 de ore după depunerea ouălor
Ziua 11-12: Eclosia (adulții ies din carcasa pupei).

Femele devin mature din punct de vedere sexual la 8-10 ore după eclosie

– Timpul de generare al Drosophila melanogaster variază în funcție de temperatură. Ciclul de mai sus este pentru o temperatură de aproximativ 22°C (72°F). Muștele crescute la o temperatură mai scăzută (până la 18°C, sau 64°F) vor avea nevoie de aproximativ de două ori mai mult timp pentru a se dezvolta.
– Femelele pot depune până la 100 de ouă/zi.
– Femelele virgine sunt capabile să depună ouă; cu toate acestea, acestea vor fi sterile și puține la număr.

După ce ouăle eclozează, larvele mici ar trebui să fie vizibile în mediul de creștere. Dacă mediul de cultură este alb, căutați mica zonă neagră (cârligele gurii) de la capul larvelor. Unele medii preamestecate uscate sunt albastre pentru a ajuta la identificarea larvelor, însă acest lucru nu este o necesitate și, cu puțină răbdare și practică, larvele sunt ușor de văzut. În plus, pe măsură ce larvele se hrănesc, ele perturbă suprafața netedă a mediului și, astfel, doar uitându-se la suprafață, se poate spune dacă sunt prezente larvele. Cu toate acestea, este întotdeauna o idee bună să se verifice de două ori cu ajutorul unui microscop stereo. După cel de-al treilea stadiu, larvele vor începe să migreze în susul flaconului de cultură pentru a se transforma în pupă.

Îngrijirea, întreținerea și manipularea Drosophilei

Introducere
Pentru a încorpora muște de fructe în sala de clasă, va fi necesar să se mențină culturi de muște pentru manipulare în cadrul încrucișărilor și ca rezervă pentru orice incident care ar putea apărea. Cultivarea este foarte ușoară și se recomandă ca elevii să își întrețină propriile culturi de muște. În acest fel, fiecare elev sau grup de elevi va fi direct responsabil de îngrijirea și întreținerea pe termen lung a muștelor, inclusiv de realizarea unor populații mari de culturi pentru încrucișările lor. Atunci când sunt implicați în mod direct, elevii dobândesc competență și o mai bună înțelegere a cerințelor și comportamentului muștelor. Profesorul ar trebui să rămână un îndrumător, nu un conferențiar, ajutând studenții să învețe tehnicile. Instructorul trebuie să mențină culturi de rezervă ale tuturor tulpinilor și mutanților utilizați de studenți în cazul în care se întâmplă incidentul neprevăzut menționat anterior și culturile studenților mor sau se amestecă între ele. Pierderea culturilor este mai degrabă o excepție decât o regulă și, atâta timp cât studenții își repun în cultură muștele în mod regulat și nu are loc o contaminare în masă, muștele pot fi menținute timp de zeci de ani.
Butelii și flacoane
Thomas Hunt Morgan a folosit sticle de lapte de sticlă pentru experimentele sale și, într-adevăr, orice recipient va fi bun, inclusiv borcane pentru copii și recipiente asortate. Cu toate acestea, pentru ușurința cultivării și a transferului culturilor, sticlele și flacoanele uniforme reprezintă cea mai bună abordare. Ambele pot fi achiziționate de la un magazin de produse biologice. Sticlele sunt utilizate în principal pentru menținerea unor populații mari de muște, în timp ce flacoanele de cultură sunt utile pentru menținerea unor populații mai mici și reprezintă recipientul preferat pentru realizarea încrucișărilor studenților. În cazul în care se dorește să se mențină culturi de rezervă pentru o perioadă lungă de timp sau să se reutilizeze sticlele și flacoanele, este important ca acestea să fie complet curățate și sterilizate. Aceasta pentru a preveni apariția unor focare de dăunători și boli.

Pentru a curăța sticlele și flacoanele, mai întâi congelați-le pentru a omorî eventualele muște din ele. Îndepărtați alimentele, spălați-le bine, apoi sterilizați-le prin autoclavare (timp de 20 de minute la 121°C și 15 psi; dacă recipientele sunt din plastic, asigurați-vă că pot fi autoclavate) sau spălați-le într-o soluție de înălbitor cu clor 10%.

Buteliile și flacoanele pot fi achiziționate într-o varietate de dimensiuni și materiale. Sticla este eficientă, totuși, dacă este scăpată, un elev ar putea pierde 2 săptămâni de date dintr-o singură vărsare. Sunt disponibile flacoane de plastic autoclavate (sterile) și sunt de preferat pentru utilizarea de către studenți. Dimensiunile flacoanelor variază de la 96 mm pe 25 mm la dimensiuni mai mari, însă dimensiunea mai mică este recomandată pentru realizarea de încrucișări și menținerea culturilor mici. Există o varietate de dopuri disponibile, de la dopuri din bumbac moale la dopuri din spumă. Aceasta este o chestiune de preferință și de costuri, totuși bumbacul funcționează bine și poate fi cumpărat de la o farmacie locală în caz de nevoie.
Unde se pot cumpăra consumabile:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, o divizie a Genesee Scientific
Cum arată acestea:

Microscop stereoFlacon pentru DrosophilaSticle pentru Drosophila

Alimentul pentru muște
Primul pas în pregătirea flacoanelor de cultură este adăugarea mediului alimentar. Există o varietate de tipuri de hrană disponibile pentru muște; unele necesită gătire, iar altele se cumpără deja preparate și deshidratate. Acestea din urmă pot fi achiziționate de la o companie de aprovizionare biologică. Acest lucru este, desigur, mult mai rapid și mai ușor decât pregătirea mediilor gătite, atât de mult încât elevii își pot umple propriile fiole cu medii. Cu toate acestea, trebuie să fie complet rehidratat pentru cele mai bune rezultate, deoarece aceasta este singura sursă de apă pentru adulți și larve. Prin urmare, urmați sugestiile de mai jos pentru a asigura un mediu complet hidratat:

Mediu deshidratat
Adaugați mediul uscat în flacon sau fiolă până la aproximativ 1/5 până la 2/5 din volum. Adăugați apă până când mediul pare complet umezit. Lăsați flaconul să stea câteva minute, adăugând apă suplimentară dacă este necesar, până când mediul este complet hidratat. Suprafața trebuie să fie umedă, cu un aspect strălucitor și nu trebuie să existe spații în mediu. În cazul în care mediul nu este complet hidratat, producția de culturi viguroase este compromisă. Muștele pot fi adăugate la câteva minute după ce mediul a fost hidratat. Nu uitați să adăugați câteva boabe (dar nu mai mult) de drojdie pe suprafața mediului înainte de a adăuga muștele.

Mediu gătit
Când se distribuie mediul gătit, acesta trebuie să umple flaconul, sticla sau fiola de cultură cu 1/5 până la 2/5 din plin. Țineți mediul afară peste noapte pentru a se întări, păstrând flacoanele acoperite cu o pânză pentru a împiedica muștele sălbatice să depună ouă în ele. A doua zi, adăugați drojdia și dopurile. Puneți la frigider fiolele de mediu nefolosite. Mediile fierte pot fi păstrate în frigider timp de câteva săptămâni. Lăsați mediul să se încălzească la temperatura camerei înainte de a adăuga muștele. Nu lăsați mediile să se usuce.
Mediu
Cel mai simplu mod de a crește muște este la temperatura camerei. Cu toate acestea, condiția optimă de creștere este o temperatură de 25°C și 60% umiditate. În aceste condiții, timpul de generare este mai scurt (9-10 zile de la ou la adult). Cu excepția cazului în care echipamentul este ușor disponibil, acest lucru nu este necesar pentru creșterea și încrucișarea cu succes a muștelor. Este preferabil ca muștele să fie ținute departe de curenți de aer și de lumina directă a soarelui sau de sursele de căldură. Acestea vor usca rapid mediul, necesitând schimbări frecvente de mediu și potențialul de a deshidrata muștele.
Anestetizarea muștelor
Problema cu muștele de fructe este că ele zboară! Prin urmare, au fost dezvoltate o varietate de metode de anestezie a muștelor. Sunt incluse eterul, mărci comerciale precum Flynap, dioxidul de carbon și răcirea. Fiecare are punctele sale forte și punctele slabe. Eterul este inflamabil, are un miros puternic și va ucide muștele dacă acestea sunt supraeterizate (și poate anestezia elevii mai tineri!). Flynap, de la Carolina Biological, este murdar și are un miros pe care unii îl consideră ofensator. Cu toate acestea, fiecare dintre acestea necesită un echipament cu costuri reduse, care poate fi achiziționat cu ușurință. Dioxidul de carbon funcționează foarte bine, menținând muștele imobile pentru perioade lungi de timp fără efecte secundare, însă covorașele (blocurile) de CO2 sunt scumpe și sunt necesare o sursă de CO2 (de obicei o sticlă) și un sistem de livrare (flacoane și clești), ceea ce crește costurile. Dacă sunteți descurcăreți, se poate utiliza CO2 emis de tabletele Alka-Seltzer pentru a anestezia muștele pentru perioade scurte de timp. Pregătiți o eprubetă mare cu un sistem de tuburi și dopuri. Adăugați apă în tub, apoi tableta Alka-Seltzer. Va fi emis gazul dioxid de carbon.

Cel mai puțin dăunător pentru muște este fie dioxidul de carbon, fie anestezia prin răcire. Dintre aceste două opțiuni, răcirea este cea mai simplă, necesitând doar un congelator, gheață și cutii Petri. În plus, este singura metodă care nu va afecta neurologia muștelor, prin urmare, studiile de comportament pot începe după ce muștele s-au încălzit suficient.
Anestetizarea muștelor prin răcire
Pentru a incapacita muștele, introduceți flaconul de cultură în congelator până când muștele nu se mai mișcă, în general 8-12 minute. Aruncați muștele pe o suprafață răcită. Aceasta poate fi construită folosind partea superioară a unei farfurii Petri, adăugând gheață pisată, apoi așezând partea inferioară a farfuriei Petri deasupra. Adăugarea muștelor în acest sistem le va menține la rece suficient de mult timp pentru a face fiecare experiment. Pur și simplu puneți muștele înapoi în flaconul de cultură atunci când ați terminat. Muștele se vor „trezi” relativ repede odată ieșite din gheață, așa că păstrați-le reci. Această metodă nu are efecte secundare de lungă durată, deși este posibil ca muștele lăsate prea mult timp în frigider să nu-și mai revină. O altă modalitate de a păstra muștele la rece este adăugarea de apă în pungi de congelare de tip zip-lock, plasarea în congelator cu o farfurie Petri așezată pe pungă și lăsarea la congelare.
Transferul muștelor dintr-un flacon în altul
Muștele trebuie transferate la fiecare 10-14 zile. Studenții ar trebui să păstreze o cultură de rezervă a muștelor lor, iar instructorul ar trebui să păstreze culturi de rezervă ale tuturor tulpinilor de muște. Există două moduri de bază de a transfera muștele atunci când se formează noi culturi. Una dintre ele nu necesită anestezie, ci mâini rapide.
A) Se pune o pâlnie în gura unui flacon de cultură proaspăt, în care s-a adăugat deja mediul. În flaconul vechi (cel cu muștele în el), bateți ușor muștele în jos prin tasarea ușoară a flaconului pe o suprafață moale, cum ar fi un tampon de șoarece. Muștele vor cădea pe fundul flaconului și vor rămâne acolo timp de câteva secunde (nu mai mult de atât!), timp suficient pentru a scoate rapid dopul de pe flacon, a-l răsturna în pâlnie și a bate ușor, împreună, cele două flacoane pentru a forța muștele să coboare în noul flacon.
B) O metodă alternativă este de a pune muștele în congelator timp de aproximativ 8 minute. Acest lucru va face ca muștele să cadă într-o stare de stupoare. După ce plasați o pâlnie pe noul flacon, răsturnați flaconul cu muște nemișcate în pâlnie. Acest lucru nu este la fel de amuzant, dar nu veți avea muște care să zboare prin clasă.
Sexul muștelor
Este destul de ușor să deosebești masculii de femele și, cu puțină practică, elevii vor deveni încrezători în capacitatea lor de a face acest lucru. Observați că masculii sunt în general mai mici și au abdomenul mai închis la culoare și mai rotunjit. Colorația abdomenului este cel mai ușor de recunoscut. În plus, masculii au piepteni sexuali tarsali pe prima pereche de picioare. Aceștia sunt negri și foarte distincți, dar pot fi văzuți doar cu o mărire relativ mare. Cu puțină practică, prin observarea abdomenului, elevii vor deveni pricepuți în a identifica cu precizie sexul muștelor. Sexarea muștelor este esențială atunci când se fac încrucișări, așa că asigurați-vă că elevii sunt încrezători în identificarea diferenței dintre sexe. Pentru ca elevii să se simtă confortabil cu sexarea muștelor, dați-le sau puneți-i să obțină 25 sau mai multe muște de sex mixt și permiteți-le să sorteze muștele în două grămezi, masculi și femele. Ceilalți elevi din grup și instructorul trebuie să verifice sortarea. Fiecare membru al grupului ar trebui să fie capabil să sexeze muștele.
Imagini de masculi și femele

Rețineți abdomenul mai întunecat și aspectul mai rotunjit al masculului. De asemenea, femelele tind să fie mai mari.
Colectarea femelelor virgine
În timp ce este o chestiune simplă de a plasa femelele virgine cu masculi, este important să recunoaștem factorul timp implicat pentru obținerea de virgine. Femelele rămân virgine timp de numai 8-10 ore după ecluzare și trebuie colectate în acest interval de timp. NOTĂ: Femelele au capacitatea de a stoca sperma după o singură împerechere, astfel încât, dacă femela pentru o încrucișare nu este virgină, nu veți cunoaște genotipul masculului utilizat pentru încrucișarea dumneavoastră. Se recomandă cu insistență să obțineți mai multe femele virgine în cazul în care se face o greșeală de identificare sau dacă musca moare înainte de împerechere și de depunerea ouălor. Într-o cultură puternică, ar trebui să fie ușor de obținut mai multe femele virgine. Deși femelele sunt capabile să depună ouă ca virgine, ele vor fi sterile și nu vor produce larve. Mai jos sunt prezentate trei modalități de a obține virgine, „metoda îndepărtării” fiind cea mai încurajată pentru începători.
Metoda îndepărtării
Îndepărtați toate muștele cu 8-10 ore înainte de colectare (în general, acest lucru se face la prima oră a dimineții). Inspectați vizual suprafața alimentelor pentru a vă asigura că muștele au fost îndepărtate complet. După 8-10 ore (de obicei înainte de a pleca de la serviciu) colectați toate femelele care sunt prezente. Toate vor fi virgine. Puneți-le într-o fiolă de cultură proaspătă și așteptați 2-3 zile pentru a căuta larve. Femelele virgine pot depune ouă, dar acestea vor fi sterile. Deoarece sunt sensibile la fotoperioadă, femelele tind să se închidă devreme dimineața. Prin urmare, colectarea timpurie va asigura un număr cât mai mare de femele virgine pentru experimente. Cu toate acestea, colectarea este posibilă și mai târziu în cursul zilei.
Metoda vizuală
Puterea de a recunoaște femelele virgine înlătură necesitatea de a goli flacoanele de cultură în timp util și permite studenților să colecteze propriile femele fără a fi nevoiți să vină la orele de curs în momente ciudate ale zilei. Rețineți că femelele virgine sunt mult mai mari decât femelele mai bătrâne și nu au colorația închisă a femelelor mature. În plus, în primele ore după închidere, va fi vizibilă o pată verzuie închisă (meconiu, rămășițele ultimei mese înainte de a se transforma în pupă) pe partea inferioară a abdomenului.
Ciclarea temperaturii
Este posibil să se maximizeze numărul de virgine într-o colectare de dimineață prin utilizarea ciclării temperaturii. Atunci când culturile sunt menținute la o temperatură de 18°C, dezvoltarea este încetinită, astfel încât femelele nu se vor împerechea decât după 16 ore de la închidere. Prin îndepărtarea muștelor după-amiaza/seara și plasarea flacoanelor într-un incubator la 18°C, 98% din muștele obținute dimineața vor fi virgine. Plasarea fecioarelor virgine în propriile fiole timp de 2-3 zile va elimina cei 2% care nu sunt virgine.
Imagini de masculi și femele virgine:

Încrucișarea muștelor
După ce femelele sunt considerate virgine, se adaugă masculii. Atunci când se stabilesc încrucișări, un raport de 3:1 între femelele virgine și masculi este ideal. În general, masculii se vor împerechea mai eficient dacă s-au maturizat 3 zile sau mai mult. Asigurați-vă că selectați masculi puternici și sănătoși; cu cât muștele sunt mai bătrâne, cu atât eficiența împerecherii este mai scăzută. Împerecherea are loc rapid, iar comportamentul este interesant de urmărit, dar nu va fi abordat aici. Femelele încep să depună ouă fertile la scurt timp după împerechere. Consultați graficul ciclului de viață pentru a găsi dovezi ale larvelor F1. Îndepărtați adulții odată ce s-a stabilit că sunt prezente suficiente larve (de obicei, la 7-8 zile după încrucișare), deoarece este posibil să nu puteți distinge părinții de generația F1.
Urmăcirea muștelor: Morga
Aceasta este o necesitate nefericită atunci când se folosesc muștele. Se folosește în general o sticlă sau un pahar cu apă cu săpun, sau ulei mineral. Aruncați muștele anesteziate direct în apa cu săpun sau în uleiul mineral unde se îneacă. O sticlă (pahar sau borcan cu capac cu șurub) plină cu etanol sau izopropanol poate fi, de asemenea, folosită ca morgă.
Basic Drosophila Genetics Nomenclature and Definitions

Mustele Drosophila melanogaster au 4 cromozomi.
Genotipul se scrie ca:

Cromozomul
Cromozom sau Cromosom / Cromozom

Această nomenclatură obișnuită arată un cromozom în partea de sus și omologul său în partea de jos, așa cum ar apărea cromozomii în timpul meiozei la contribuția gameților.

Când se scrie genotipul, în general, cromozomii sunt separați cu punct și virgulă.

Cromozomul X; cromozomul II; cromozomul III; cromozomul IV

Cromozomul de tip sălbatic este notat cu „+” sau WT

Mutațiile dominante se scriu cu majusculă:
De exemplu: Bar sau B

Mutațiile recesive se scriu cu literă minusculă:
De exemplu: alb sau w

Mutațiile sunt alele (forme alternative ale unei gene care ocupă un anumit locus pe un cromozom) care se moștenesc odată cu cromozomii.

Homozigot – Un individ cu aceeași alelă la loci corespunzători de pe cromozomi omologi.

Heterozigot – Un individ cu alele diferite la loci corespunzători de pe cromozomii omologi.

Genotip – Genele pe care le posedă un organism.

Fenotip – Atributele observabile ale unui organism.

P1 – Generația parentală.

F1 – Generația filială, sau generația descendenților. F1 este prima generație de descendenți.

F2 – A doua generație de descendenți.
Alte resurse web excelente:

Gerard Manning a scris o introducere simplă în genetica Drosophilei.

Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System de Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem de David Bilder și Kenneth D. Irvine (2017).