Diagnosticul infecției cu Legionella

Abstract

Legionellae, care sunt cauze importante de pneumonie la om, continuă să fie etichetate în mod incorect ca agenți patogeni exotici. Capacitatea de diagnosticare a infecției cu Legionella este limitată de natura nespecifică a caracteristicilor clinice și de deficiențele testelor de diagnostic. În ciuda îmbunătățirilor recente, testele de diagnosticare existente pentru infecția cu Legionella fie nu au sensibilitatea necesară pentru a detecta toate legionellae importante din punct de vedere clinic, fie nu sunt în măsură să furnizeze rezultate într-un interval de timp util din punct de vedere clinic. Înțelegerea epidemiologiei locale a Legionella este importantă pentru a lua decizii cu privire la oportunitatea de a testa infecția cu Legionella și la testele de diagnosticare care trebuie utilizate. În majoritatea situațiilor, utilizarea atât a testului antigenului urinar, cât și a culturii de spută reprezintă cea mai bună combinație de diagnostic. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este un instrument promițător, dar testele standardizate nu sunt disponibile în comerț. Lucrările viitoare trebuie să se concentreze asupra dezvoltării testelor de testare a antigenului urinar care să detecteze o gamă mai largă de legionellae patogene și asupra dezvoltării de teste PCR standardizate.

Boala legionarilor continuă să aibă reputația de a fi o infecție exotică. Dimpotrivă, atunci când sunt căutate sistematic, speciile de Legionella sunt recunoscute în mod constant ca fiind una dintre cauzele comune de pneumonie. Cu toate acestea, în afara mediului de cercetare, diagnosticele confirmate de legioneloză sunt rare. Acest eșec de a diagnostica boala legionarilor în practica de rutină este în mare parte rezultatul a 3 factori: incapacitatea de a distinge clinic și radiografic boala legionarilor de alte cauze de pneumonie, eșecul de a comanda teste de diagnostic pentru infecția cu Legionella și deficiențele testelor de diagnostic disponibile. Boala legionarilor este descrisă mai degrabă ca un diagnostic evaziv decât ca o infecție exotică.

Deși metodele de diagnostic s-au îmbunătățit în cei 25 de ani de când Legionella pneumophila a fost descrisă pentru prima dată, niciun test disponibil în prezent nu este capabil să diagnosticheze boala legionarilor în timp util cu un grad ridicat de sensibilitate și specificitate. Într-adevăr, unii autori au contestat comandarea de rutină a oricăror teste microbiologice pentru pacienții cu pneumonie, susținuți de date care sugerează că astfel de teste nu influențează în mod semnificativ alegerea terapiei cu antibiotice și rezultatul pacientului . Recent, Marrie a susținut că această abordare a diagnosticului de boală a legionarilor este greșită. Neefectuarea testelor de depistare a infecției cu Legionella poate întârzia recunoașterea focarelor de boală a legionarilor, poate rata schimbările în epidemiologia bolii (inclusiv dezvoltarea rezistenței antimicrobiene) și poate împiedica persoanele să ceară despăgubiri pentru infecția dobândită la locul de muncă. Este important faptul că este posibil să se selecteze un subset de pacienți pentru care randamentul testelor de diagnostic pentru infecția cu Legionella este ridicat și care ar beneficia de un diagnostic specific.

Această trecere în revistă se concentrează pe testele actuale de diagnostic pentru infecția cu Legionella, cu un accent deosebit pe testele care oferă un diagnostic într-un interval de timp care va afecta managementul inițial al infecției. În timp ce se analizează diferitele teste de diagnostic pentru infecția cu Legionella, este important să se țină cont de mai mulți factori. În primul rând, sunt necesare teste specializate pentru a diagnostica infecția cu Legionella, iar acestea trebuie să fie solicitate în mod specific de către clinician. În al doilea rând, este important să se aprecieze distincția dintre performanța unui test într-un laborator de cercetare și ceea ce poate fi realizat în mod realist într-un laborator de diagnosticare local. A fost documentată o variație considerabilă între laboratoare în ceea ce privește capacitatea de a cultiva legionellae , iar acest lucru este probabil să se extindă și la alte teste. În al treilea rând, interpretarea performanței testelor de diagnosticare este îngreunată de lipsa unui „standard de aur” adecvat. Datele calculate privind sensibilitatea și specificitatea vor varia în funcție de diferitele standarde de comparație. În al patrulea rând, utilitatea testelor de diagnosticare este influențată de epidemiologia locală a Legionella. L. pneumophila serogrupul 1 este cauza predominantă a legionelozei în multe, dacă nu în majoritatea zonelor din lume, iar infecția cu acest organism este mai ușor de diagnosticat decât infecția cu alte specii și serogrupuri de Legionella. În unele regiuni, alte specii și serogrupuri sunt mai importante. De exemplu, Legionella longbeachae este o cauză majoră de legioneloză în Australia și Noua Zeelandă , unde este adesea asociată cu expunerea la amestec pentru ghivece . Infecția cu această specie nu va fi detectată prin testele actuale pentru antigenul urinar și va fi ratată de laboratoarele care efectuează teste serologice numai pentru L. pneumophila.

Cultura

Diagnosticul prin cultură necesită medii speciale, prelucrarea adecvată a probelor și expertiză tehnică (tabelul 1). Sunt necesare câteva zile pentru a obține un rezultat pozitiv, cele mai multe colonii de Legionella fiind detectate în 3-5 zile. Mediul standard utilizat pentru cultivarea legionellei este agarul cu extract de drojdie de cărbune tamponat (BCYE) suplimentat cu α-cetoglutarat, cu sau fără agenți antimicrobieni. Acest mediu furnizează fier și L-cisteină, ambele fiind esențiale pentru dezvoltarea legionellei. Creșterea unor specii de Legionella (de exemplu, Legionella micdadei și Legionella bozemanii) este îmbunătățită prin suplimentarea agarului BCYE cu albumină serică bovină, iar adăugarea de coloranți indicatori în mediu poate ajuta la identificare. Mediile de cultură care conțin cefamandole vor inhiba creșterea speciilor de Legionella care nu produc β-lactamază, cum ar fi L. micdadei și L. bozemanii .

Legionellae pot fi izolate dintr-o varietate de tipuri de probe, deși secrețiile tractului respirator inferior (de ex, spută și probe de bronhoscopie) sunt probele de elecție. Limitarea majoră a culturii de spută este faptul că mai puțin de jumătate dintre pacienții cu boala legionarilor produc spută . Alți factori influențează sensibilitatea culturii odată ce se obține o probă de spută. Bacteria Legionella poate supraviețui slab în secrețiile respiratorii, iar aceste probe ar trebui să fie procesate cu promptitudine. Unii pacienți cu boala legionarilor produc spută care are relativ puțină purulență; aceste probe pot fi respinse de laboratoarele care resping probele de spută care conțin puține leucocite polimorfonucleare . În consecință, criteriile de respingere nu ar trebui să fie aplicate eșantioanelor de spută trimise pentru cultura Legionella. Experiența personalului de laborator este, de asemenea, importantă, iar laboratoarele cu experiență în cultura Legionella au mai multe șanse să recupereze organismul.

Sensibilitatea estimată a culturii de spută variază de la <10% la ∼80% și variază în funcție de diferite standarde de comparație și de fiecare laborator în parte . În practică, este probabil ca rezultatele mai bune să fie obținute doar de către laboratoarele cu un interes special pentru infecția cu Legionella, iar sensibilitățile sunt de obicei <50% atunci când rezultatele serologice sunt utilizate ca standard. Probele bronhoscopice sunt susceptibile de a produce un randament diagnostic mai mare decât probele de spută expectorată.

Speciile de Legionella pot fi izolate din hemoculturi, dar randamentul este slab. Creșterea legionellei este menținută de mediile de hemocultură de rutină, dar este posibil să nu activeze alarma aparatelor de hemocultură comerciale . În consecință, sunt necesare subculturi oarbe pe medii solide. În general, randamentul hemoculturilor este scăzut și este puțin probabil să influențeze managementul clinic.

Direct Fluorescent Antibody (Dfa) Staining

Direct Fluorescent Antibody (Dfa) Staining

DDFA staining can detect legionellae in respiratory secretions and tissue samples. Această tehnică are avantajul de a furniza un rezultat în 2-4 h, dar este solicitantă din punct de vedere tehnic și trebuie efectuată de personal de laborator cu experiență. Sensibilitatea raportată a colorației DFA variază, este în mod constant mai mică decât cea a culturii și este mai puțin cunoscută cu precizie pentru alte specii decât L. pneumophila. Pentru secrețiile tractului respirator inferior, sensibilitățile variază în general între 25 % și 66 %, iar probele de lichid de lavaj bronhoalveolar au un randament mai mare decât probele transtraheale sau de spută . Specificitatea colorației DFA a fost estimată la ∼94% , deși este probabil ca testul să fie mai puțin specific în mâini neexperimentate. Rezultatele fals-pozitive pot apărea din cauza reacțiilor încrucișate cu alte bacterii, inclusiv Bacteroides fragilis, specii de Pseudomonas, specii de Stenotrophomonas și specii de Flavobacterium. Reacțiile încrucișate pot fi mai puțin problematice atunci când se utilizează agenți DFA cu anticorpi monoclonali. Problemele legate de sensibilitate și specificitate au limitat utilizarea colorației DFA, iar un rezultat pozitiv al DFA în absența altor dovezi de susținere nu este acum, în general, acceptat ca fiind suficient pentru diagnosticul infecției cu Legionella.

Detecția antigenului urinar

Detecția antigenului solubil al Legionella în probele de urină este o metodă rapidă care oferă un diagnostic precoce al infecției cu Legionella și a fost un instrument util pentru investigarea focarelor de boală a legionarilor . Kiturile comerciale care utilizează atât metodologia RIA, cât și cea EIA sunt disponibile de mai mulți ani și au caracteristici de performanță similare. Recent, a fost dezvoltat un test imunocromatografic (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) care are o sensibilitate și o specificitate similare cu EIA . Acest test este ușor de efectuat și poate furniza un rezultat în 15 min.

Pentru detectarea serogrupului 1 de L. pneumophila, testele cu antigen urinar au sensibilități în intervalul 70%-100% și specificități care se apropie de 100% . Sensibilitățile pot fi crescute cu până la 20% prin concentrarea de 25 de ori a probelor de urină înainte de testare . Dezavantajul major al acestor teste este incapacitatea lor de a detecta în mod fiabil alte organisme decât L. pneumophila serogrupul 1. Au fost dezvoltate teste cu spectru larg care detectează antigenii solubili de la o mare varietate de specii de Legionella, dar nu sunt disponibile în comerț. Biotest Legionella Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) este destinat să detecteze alte legionellae decât L. pneumophila serogrupul 1, dar face acest lucru mai puțin fiabil decât detectează L. pneumophila serogrupul 1 . Au apărut rezultate fals-pozitive la antigenul urinar la pacienții cu boala serică .

Antigenuria cu legionella poate fi detectată încă de la 1 zi de la debutul simptomelor și persistă timp de zile sau săptămâni. Într-un caz, s-a documentat că excreția de antigen a avut loc timp de >300 de zile . Antigenele solubile de Legionella au fost, de asemenea, detectate în alte probe decât urina, inclusiv în probe de spută, țesut pulmonar, ser și lichid pleural, deși utilizarea acestor probe nu a fost pe deplin evaluată.

Testarea antigenelor urinare este acum un instrument stabilit și valoros pentru diagnosticarea bolii legionarilor, în special în regiunile în care serogrupul 1 de L. pneumophila este cea mai frecventă cauză a bolii. În locațiile în care doar o minoritate de infecții sunt cauzate de L. pneumophila serogrupul 1, testele cu antigen urinar disponibile în prezent contribuie mai puțin la testele de laborator existente.

Testarea serologică

Testarea serologică pentru infecția cu Legionella este un instrument epidemiologic valoros, dar are un impact redus asupra procesului de luare a deciziilor clinice din cauza timpului de așteptare până când un rezultat este disponibil. Anticorpii produși ca răspuns la infecție sunt, în general, un amestec de IgA, IgM și IgG, iar testele ar trebui să detecteze toate tipurile pentru o sensibilitate optimă. Măsurarea IgM specifice este un marker nesigur al infecției acute, deoarece anticorpii IgM pot persista pentru perioade lungi de timp. Seroconversia poate dura câteva săptămâni, ceea ce reprezintă o limitare majoră a testelor serologice. În majoritatea cazurilor, o creștere de 4 ori a titrului de anticorpi este detectată în decurs de 3-4 săptămâni, dar, în unele cazuri, acest lucru poate dura >10 săptămâni . Obținerea prea timpurie a probelor de ser în faza de convalescență duce, fără îndoială, la multe rezultate fals-negative și, probabil, explică parțial cei 20%-30% de pacienți cu boala legionarilor care se presupune că nu dezvoltă un răspuns detectabil al anticorpilor . Cu toate acestea, este clar că o parte dintre persoanele cu infecție dovedită cu Legionella nu prezintă o seroconversie detectabilă . În practică, clinicienii ar trebui să fie încurajați să obțină probe de ser în faza de convalescență la 3 săptămâni de la debutul bolii pentru a fi testate în paralel cu serul obținut în timpul fazei acute. Dacă nu există seroconversie după această perioadă de timp și se suspectează în continuare o infecție cu Legionella, ar trebui să se obțină o probă suplimentară din faza de convalescență.

Dintre diferitele metode de detectare a anticorpilor care sunt disponibile, imunofluorescența indirectă este testul standard de referință. O creștere de 4 ori sau mai mare a titrului de anticorpi reciproci față de ⩾128 este considerată diagnostică. Titrul de anticorpi reciproci în fază acută de ⩾256 în prezența pneumoniei a fost considerat cândva suficient pentru un diagnostic prezumtiv, dar s-a demonstrat că acest lucru nu este fiabil , în special având în vedere prevalența ridicată a pozitivității anticorpilor anti-Legionella în rândul unor persoane fără dovezi clinice de legioneloză. Testarea probelor serice unice nu are practic niciun rol.

Un alt dezavantaj al testării serologice este incapacitatea de a detecta cu precizie toate speciile și serogrupurile de Legionella. Deși seroconversia la L. pneumophila serogrupul 1 este în general considerată ca fiind foarte predictivă pentru boală, sensibilitatea și specificitatea seroconversiei la alte specii și serogrupuri nu a fost confirmată în mod riguros. În plus, formarea de anticorpi cu reactivitate încrucișată între membrii familiei Legionellaceae poate face dificilă determinarea speciei sau serogrupului infectant. Unii pacienți cu infecție cu serogrup 1 care nu este L. pneumophila vor avea seroconversie la L. pneumophila serogrup 1 . În schimb, identificarea pe bază de secvență a produselor Legionella PCR de la pacienții care au avut seroconversie la alte specii de Legionella decât L. pneumophila indică faptul că unii au fost probabil infectați cu L. pneumophila (observații nepublicate). Anticorpii cu reactivitate încrucișată se găsesc, de asemenea, ocazional la pacienții cu infecții cauzate de bacterii care nu sunt Legionella, inclusiv pseudomonade, micobacterii, specii de Bacteroides și specii de Campylobacter. O reacție încrucișată interesantă apare între L. bozemanii și Rickettsia typhi ca urmare a unui antigen comun .

Amplificarea acidului nucleic

Recent, tehnicile de detectare a ADN-ului s-au dovedit promițătoare pentru diagnosticarea rapidă a infecției cu Legionella. PCR permite amplificarea specifică a unor cantități infime de ADN de Legionella, oferă rezultate într-un interval de timp scurt și are potențialul de a detecta infecțiile cauzate de orice specie și serogrup de Legionella. În prezent, Legionella PCR este disponibilă doar într-un număr limitat de laboratoare care utilizează o varietate de teste interne.

PCR a fost utilizată cu succes pentru a detecta ADN-ul Legionella într-o serie de probe de mediu și clinice. Atunci când se testează probe din tractul respirator inferior, s-a demonstrat în mod repetat că PCR are o sensibilitate egală sau mai mare decât cultura . Într-adevăr, PCR ar putea fi considerat testul de alegere pentru pacienții care produc spută. Rolul PCR pentru testarea altor tipuri de probe este mai puțin clar. ADN-ul Legionella poate fi detectat în probele de urină, ser și leucocite obținute de la pacienții cu boala legionarilor cu sensibilități de 30%-86% . Este probabil ca sensibilitatea PCR să crească atunci când se testează probe care sunt obținute la începutul evoluției bolii și atunci când se testează >1 tip de probă de la fiecare pacient . Tampoanele de gât pot fi, de asemenea, o probă adecvată pentru testarea PCR, dar această aplicație a fost evaluată doar într-un singur studiu .

Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a stabili o metodă PCR standard care să fie suficient de robustă pentru a fi utilizată în afara cadrului unui laborator de cercetare. Aplicarea sa la probele non-respiratorii este deosebit de atractivă, deoarece astfel se va eluda problema pacienților care nu produc probe de spută. Dezvoltarea unui test PCR optim a fost îngreunată de contaminarea intermitentă a unor kituri comerciale de extracție a ADN-ului cu ADN de Legionella . Utilizarea acestor kituri pentru a procesa probele poate duce la rezultate fals-pozitive și evidențiază importanța includerii unor controale adecvate în fiecare serie de teste.

Strategia de testare

Pentru că boala legionarilor nu poate fi distinsă clinic sau radiografic de alte cauze de pneumonie, decizia de a testa infecția cu Legionella poate fi dificilă și este adesea luată în mod eronat. Este important să fiți familiarizați cu epidemiologia locală. Unele laboratoare din zonele în care speciile de Legionella sunt o cauză frecventă de pneumonie au ales să cultive de rutină toate probele de spută obținute de la pacienții cu pneumonie pe medii de Legionella. Cu toate acestea, puține laboratoare ar fi în măsură să justifice costul suplimentar asociat culturii de rutină a Legionella. În cele mai multe locații, incidența infecției cu Legionella este necunoscută, iar decizia de a solicita teste de diagnosticare a infecției cu Legionella este, de obicei, limitată la pacienții cu risc, la pacienții cu pneumonie severă și la scenarii de epidemie. Este cu siguranță posibil să se selecteze un subset de pacienți pentru care randamentul testelor de diagnosticare a Legionella este probabil să fie relativ ridicat. Acest grup include persoanele în vârstă, fumătorii, indivizii imunodeprimați, cei cu boli pulmonare cronice, pacienții care locuiesc în spitale cu rezerve de apă colonizate de Legionella și indivizii expuși la amestec pentru ghiveci. Incidența legionelozei este mai mare în rândul pacienților cu pneumonie severă, iar toți pacienții cu pneumonie care sunt internați într-o unitate de terapie intensivă ar trebui să fie testați pentru această infecție.

În locațiile în care serogrupul 1 de L. pneumophila este cauza predominantă a infecției cu Legionella sau în timpul unui focar de infecție cu serogrupul 1 de L. pneumophila, testul antigenului urinar este un instrument de diagnostic deosebit de valoros. Dezvoltarea unui test comercial pentru antigenul urinar care să detecteze în mod fiabil și alți agenți patogeni umani ai Legionella ar reprezenta un progres major și ar face probabil ca acest test de diagnostic să devină testul de alegere în aproape toate mediile. În locațiile geografice în care alte legionellae decât L. pneumophila serogrupul 1 sunt agenți patogeni importanți din punct de vedere numeric, testele actuale de antigen urinar sunt încă utile, dar nu ar trebui să fie utilizate ca unic instrument de diagnosticare. Dacă este disponibil, testul PCR pentru Legionella combinat cu testul antigenului urinar este probabil cea mai bună strategie de testare inițială care va detecta toate speciile de Legionella și va furniza rezultate într-un interval de timp care va afecta managementul clinic.

Dacă testul PCR nu este disponibil, testul antigenului urinar combinat cu o cultură a probelor din tractul respirator inferior este cea mai bună combinație de teste. Cultura rămâne un instrument de diagnostic important, dar sensibilitatea sa relativ scăzută și dependența de disponibilitatea unei probe din tractul respirator inferior o fac inadecvată ca unic test de diagnostic. Deși testarea serologică nu are niciun impact asupra managementului inițial, aceasta poate fi utilă în cazul în care nu se pune un diagnostic specific în timpul fazei acute a infecției, dar trebuie testate în paralel atât probele din faza acută, cât și cele din faza de convalescență. În timpul unui focar suspectat de legioneloză, se justifică o abordare agresivă a diagnosticului, care ar implica utilizarea unei combinații de metode de testare.

Speciile Legionella pot provoca ocazional febra Pontiac, o boală acută, febrilă, nepneumonică, caracterizată printr-o rată mare de atac, o perioadă scurtă de incubație și o recuperare rapidă. Diagnosticul febrei Pontiac se bazează, de obicei, pe recunoașterea caracteristicilor clinice tipice în timpul unei situații de epidemie, iar diagnosticul este confirmat prin testarea serologică a persoanelor afectate. Utilizarea culturii este în mare parte limitată la testarea probelor de mediu pentru a determina sursa focarului, deși L. pneumophila serogrupul 1 a fost izolată dintr-un aspirat traheal de la un copil cu febră Pontiac .

Concluzii

Infecția cu L. pneumophila este, fără îndoială, insuficient recunoscută. Diagnosticul se bazează pe utilizarea de teste specializate, adesea în combinație. Testele pentru antigenul urinar, cultura de spută și testarea PCR a probelor din tractul respirator inferior sunt cele mai importante instrumente de diagnostic pentru detectarea infecției cu Legionella la începutul evoluției bolii. Dezvoltarea unor teste de testare a antigenului urinar care să detecteze o gamă mai largă de legionellae patogene și dezvoltarea unor teste PCR standardizate vor reprezenta progrese majore în diagnosticarea Legionella. Disponibilitatea și utilizarea sporită a testelor de diagnostic îmbunătățite va contribui la o mai bună caracterizare a epidemiologiei bolii legionarilor, inclusiv a incidenței reale și a variației geografice.

Recunoștințe

Sunt recunoscător lui Steve Chambers pentru comentariile utile asupra articolului în manuscris.