Componentele unui sistem de bază de cromatografie lichidă de înaltă performanță sunt prezentate în diagrama simplă din figura E.
Un rezervor conține solventul . O pompă de înaltă presiune este utilizată pentru a genera și măsura un debit specificat de fază mobilă, de obicei mililitri pe minut. Un injector este capabil să introducă proba în fluxul de fază mobilă care curge continuu și care transportă proba în coloana HPLC. Coloana conține materialul de împachetare cromatografică necesar pentru a efectua separarea. Acest material de împachetare se numește fază staționară, deoarece este ținut în poziție de dispozitivul coloanei. Este necesar un detector pentru a vedea benzile de compuși separați pe măsură ce se eluează din coloana HPLC. Faza mobilă iese din detector și poate fi trimisă la deșeuri sau colectată, după cum se dorește. Atunci când faza mobilă conține o bandă de compus separat, HPLC oferă posibilitatea de a colecta această fracțiune de eluat care conține acel compus purificat pentru un studiu ulterior. Aceasta se numește cromatografie pregătitoare.
Rețineți că tubulatura și fitingurile de înaltă presiune sunt folosite pentru a interconecta componentele pompei, injectorului, coloanei și detectorului pentru a forma conducta pentru faza mobilă, proba și benzile de compuși separați.
Figura E: Sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță
Detectorul este conectat la stația de date a computerului, componenta sistemului HPLC care înregistrează semnalul electric necesar pentru a genera cromatograma pe afișajul său și pentru a identifica și cuantifica concentrația constituenților probei (a se vedea figura F). Deoarece caracteristicile compușilor eșantionului pot fi foarte diferite, au fost dezvoltate mai multe tipuri de detectoare. De exemplu, dacă un compus poate absorbi lumina ultravioletă, se utilizează un detector de absorbție UV. În cazul în care compusul este fluorescent, se utilizează un detector de fluorescență. Dacă compusul nu are niciuna dintre aceste caracteristici, se utilizează un tip de detector mai universal, cum ar fi un detector de împrăștiere a luminii prin evaporare . Cea mai puternică abordare este utilizarea mai multor detectoare în serie. De exemplu, un detector UV și/sau ELSD poate fi utilizat în combinație cu un spectrometru de masă pentru a analiza rezultatele separării cromatografice. Acest lucru oferă, dintr-o singură injecție, informații mai complete despre un analit. Practica de cuplare a unui spectrometru de masă la un sistem HPLC se numește LC/MS.
Figura F: Un sistem HPLC tipic
Funcționarea HPLC
Un mod simplu de a înțelege modul în care realizăm separarea compușilor conținuți într-o probă este de a vizualiza diagrama din figura G.
Faza mobilă intră în coloană din stânga, trece prin patul de particule și iese în dreapta. Direcția de curgere este reprezentată de săgețile verzi. Mai întâi, luați în considerare imaginea de sus; aceasta reprezintă coloana la momentul zero , când proba intră în coloană și începe să formeze o bandă. Proba prezentată aici, un amestec de coloranți galbeni, roșii și albaștri, apare la intrarea în coloană ca o singură bandă neagră.
După câteva minute , timp în care faza mobilă curge în mod continuu și constant pe lângă particulele de material de împachetare, putem observa că coloranții individuali s-au deplasat în benzi separate cu viteze diferite. Acest lucru se datorează faptului că există o competiție între faza mobilă și faza staționară pentru atragerea fiecăruia dintre coloranți sau analiți. Observați că banda de colorant galben se deplasează cel mai rapid și este pe cale să iasă din coloană. Colorantului galben îi place mai mult faza mobilă decât celorlalți coloranți. Prin urmare, se deplasează cu o viteză mai mare, mai aproape de cea a fazei mobile. Banda de colorant albastru preferă materialul de ambalare mai mult decât faza mobilă. Atracția sa mai puternică față de particule face ca aceasta să se deplaseze semnificativ mai lent. Cu alte cuvinte, este cel mai reținut compus din acest amestec de probe. Banda de colorant roșu are o atracție intermediară pentru faza mobilă și, prin urmare, se deplasează cu o viteză intermediară prin coloană. Deoarece fiecare bandă de colorant se deplasează cu o viteză diferită, suntem capabili să o separăm cromatografic.
Figura G: Înțelegerea modului de funcționare a unei coloane cromatografice – Benzile
Ce este un detector?
În timp ce benzile de colorant separate părăsesc coloana, ele trec imediat în detector. Detectorul conține o celulă de debit care vede fiecare bandă de compus separată pe un fond de fază mobilă . Un detector adecvat are capacitatea de a sesiza prezența unui compus și de a trimite semnalul electric corespunzător la o stație de date computerizată. Se face o alegere între mai multe tipuri diferite de detectoare, în funcție de caracteristicile și concentrațiile compușilor care trebuie separați și analizați, după cum s-a discutat anterior.
Ce este o cromatogramă?
O cromatogramă este o reprezentare a separării care a avut loc din punct de vedere chimic în sistemul HPLC. O serie de vârfuri care se ridică de la o linie de bază este desenată pe o axă de timp. Fiecare vârf reprezintă răspunsul detectorului pentru un compus diferit. Cromatograma este trasată de către stația de date a computerului .
Figura H: Cum se creează vârfurile
În figura H, banda galbenă a trecut complet prin celula de debit a detectorului; semnalul electric generat a fost trimis la stația de date a computerului. Cromatograma rezultată a început să apară pe ecran. Observați că cromatograma începe în momentul în care proba a fost injectată pentru prima dată și începe ca o linie dreaptă stabilită aproape de partea de jos a ecranului. Aceasta se numește linia de bază; reprezintă faza mobilă pură care trece prin celula de curgere în timp. Pe măsură ce banda galbenă de analit trece prin celula de curgere, un semnal mai puternic este trimis la computer. Linia se curbează, mai întâi în sus și apoi în jos, proporțional cu concentrația de colorant galben din banda de probă. Acest lucru creează un vârf în cromatogramă. După ce banda galbenă iese complet din celula de detectare, nivelul semnalului revine la linia de bază; celula de curgere are acum, din nou, doar fază mobilă pură în ea. Deoarece banda galbenă se deplasează cel mai rapid, eluzionând prima din coloană, ea este primul vârf extras.
Pe scurt timp după aceea, banda roșie ajunge în celula de curgere. Semnalul crește de la linia de bază în momentul în care banda roșie intră prima dată în celulă, iar vârful care reprezintă banda roșie începe să fie extras. În această diagramă, banda roșie nu a trecut complet prin celula de curgere. Diagrama arată cum ar arăta banda roșie și vârful roșu dacă am opri procesul în acest moment. Deoarece cea mai mare parte a benzii roșii a trecut prin celulă, cea mai mare parte a vârfului a fost trasată, după cum arată linia continuă. Dacă am putea reporni, banda roșie ar trece complet prin celula de curgere și vârful roșu ar fi completat . Banda albastră, cea mai puternic reținută, se deplasează cu cea mai mică viteză și se eluează după banda roșie. Linia punctată vă arată cum ar apărea cromatograma completată dacă am fi permis ca rularea să continue până la final. Este interesant de observat că lățimea vârfului albastru va fi cea mai mare deoarece lățimea benzii albastre a analitului, deși este cea mai îngustă pe coloană, devine cea mai mare pe măsură ce se eluează din coloană. Acest lucru se datorează faptului că se deplasează mai încet prin patul de material de împachetare cromatografică și necesită mai mult timp pentru a fi eluat complet. Deoarece faza mobilă curge continuu la un debit fix, acest lucru înseamnă că banda albastră se lărgește și este mai diluată. Deoarece detectorul răspunde proporțional cu concentrația benzii, vârful albastru este mai mic în înălțime, dar mai mare în lățime.
.