Cum funcționează citometria în flux?

Să ne concentrăm mai întâi asupra bazelor fundamentale ale citometriei în flux

Ce este citometria în flux?

Citometria de flux este o tehnică utilizată pentru a detecta și măsura caracteristicile fizice și chimice ale unei populații de celule sau particule. În acest proces, o probă care conține celule sau particule este suspendată într-un fluid și injectată în instrumentul citometru în flux.

Care este scopul citometriei în flux?

Citometria în flux oferă o metodă bine stabilită de identificare a celulelor în soluție și este cel mai frecvent utilizată pentru evaluarea sângelui periferic, a măduvei osoase și a altor fluide corporale. Studiile de citometrie în flux sunt utilizate pentru a identifica și cuantifica celulele imune și pentru a caracteriza tumorile hematologice maligne.1 Ele pot măsura:

• dimensiunea celulelor
• granularitatea celulelor
• ADN total
• nouă sintetizată
• expresia genică a ADN-ului
• receptorii de suprafață
• intracelulară proteine
• semnal tranzitoriu

Capacitatea de a efectua aceste măsurători într-un interval de timp foarte rapid este unul dintre avantajele cheie ale procesului citometric de flux. Acestea pot cuantifica până la trei până la șase proprietăți sau componente sunt cuantificate într-o singură probă, celulă cu celulă, pentru aproximativ 10.000 de celule, în mai puțin de un minut.

Instrumentația și metodologia citometriei în flux

Citometrele în flux preiau o suspensie de celule monodispersate, unice, neaglomerate și le trec pe rând (single file) pe lângă un fascicul laser, unde fiecare celulă trece prin fasciculul laser, împrăștie și lumina fluorescentă și sunt apoi numărate și sortate sau caracterizate în continuare.

Cele trei componente principale ale unui citometru de flux sunt sistemul fluidic, sistemul optic și sistemul electronic.

• Sistemul fluidic al unui citometru de flux este responsabil pentru transportul probelor din tubul de probă în celula de flux, pe lângă laser, sortate și/sau aruncate.
• Componentele sistemului optic includ sursele de lumină de excitație, lentilele și filtrele optice utilizate pentru a colecta și a deplasa lungimile de undă ale luminii în jurul instrumentului și sistemul de detecție care generează fotocurentul. Diferența de răspuns a lungimilor de undă din date ajută la analiza tipului de celule.
• Electronicele sau instrumentarul citometrului de flux.

Unul dintre principiile principale ale utilizării citometriei de flux este capacitatea de a analiza ciclul celular complet și de a analiza conținutul de ADN în diferite faze. Monitorizarea evenimentelor naturale ale ciclului celular poate furniza informații pentru diagnosticarea bolilor și prognosticarea terapiei. Diferitele faze ale ciclului celular pot dezvălui un conținut modificat de ADN și alte anomalii care indică prezența tumorii sau semne de moarte celulară avansată. Expresiile de date sunt stocate într-un computer prin intermediul unui software specializat de citometrie în flux asociat cu utilizarea instrumentului ales în momentul analizei. Datele de citometrie în flux sunt de obicei raportate în două moduri distincte: o histogramă și/sau un grafic cu puncte2.

Faza G1:	Arnul, ribozomii și proteinele sunt sintetizate
Faza S:	ADN-ul este replicat
Faza G2:	Reprezintă faza dintre sinteza ADN și mitoză
Faza M:	celulele sunt împărțite în două celule fiice

FACS

Sortarea celulară activată prin fluorescență (FACS) este un tip specializat de citometrie de flux. Acesta oferă o metodă de sortare a unui amestec eterogen de celule biologice în două sau mai multe containere, câte o celulă la un moment dat, pe baza caracteristicilor specifice de difuzie a luminii și fluorescență ale fiecărei celule. Se deosebește de citometria în flux prin faptul că oferă o caracterizare unică față de simpla numărare și sortare a celulelor. Este obișnuit ca cele două principii să funcționeze într-un proces de tip co-caracterizare pentru a oferi o abordare calitativă și cantitativă completă a analizei citometrice în flux.

Procesul citometric în flux:

Suspensia de celule este antrenată în centrul unui curent de lichid îngust, care curge rapid. Fluxul este aranjat astfel încât să existe o separare mare între celule în raport cu diametrul lor. Un mecanism vibrator forțează fluxul de celule să se spargă în picături individuale. Sistemul este reglat astfel încât să existe o probabilitate scăzută de a avea mai mult de o celulă pe picătură. Chiar înainte ca fluxul să se spargă în picături, fluxul trece printr-o stație de măsurare a fluorescenței, unde se măsoară caracterul fluorescent de interes al fiecărei celule.

Un inel de încărcare electrică este plasat chiar în punctul în care fluxul se sparge în picături. O sarcină este plasată pe inel în funcție de măsurarea imediat anterioară a intensității fluorescenței, iar sarcina opusă este captată pe picătură în momentul în care aceasta se rupe din flux. Picăturile încărcate cad apoi printr-un sistem de deviere electrostatică care le redirecționează în containere în funcție de sarcina lor. În unele sisteme, sarcina este aplicată direct pe flux, iar picătura care se desprinde reține o sarcină de același semn ca și fluxul. Fluxul este apoi readus la neutru după ce picătura se desprinde.

Un anticorp specific pentru o anumită proteină de suprafață celulară este asociat cu o moleculă fluorescentă și apoi adăugat la un amestec de celule. Următorul pas este procesul de fluorescență, întrucât, celulele specifice trec printr-un fascicul laser acestea sunt monitorizate. Picăturilor care conțin o singură celulă li se atribuie o sarcină pozitivă sau negativă, în funcție de faptul dacă celula are un anticorp marcat fluorescent. Picăturile care conțin o singură celulă sunt apoi detectate de un câmp electric și deviate în tuburi de colectare separate în funcție de sarcina lor, permițând o separare ușoară a celulelor marcate cu anticorpul fluorescent.

Citometrie în flux multicoloră

Citometria în flux multicoloră este o tehnică utilă atunci când se examinează populații mixte de celule, cum ar fi celulele sanguine și tisulare din probele umane și animale. În general, un anumit tip de celule este marcat cu un colorant fluorescent (markeri), cum ar fi fluoroforul sau iodura de propidiu. Capacitatea de a utiliza simultan mai mulți markeri fluorescenți permite identificarea mai multor tipuri de celule, precum și a markerilor funcționali care caracterizează mai bine fiecare eșantion. Există instrumente specializate capabile să măsoare peste 12 culori 3,4 . Acești coloranți și markeri fluorescenți sunt măsurați prin diferite lungimi de undă ale luminii emise de laser pentru a sorta în funcție de tipul de celule individuale. Fiecare marker este excitat la o anumită lungime de undă a luminii pentru a le diferenția atunci când se utilizează mai mulți markeri.

Adaptarea unui panou de colorare tipic de la 4 până la 6 culori la peste 12 culori nu este pur și simplu o chestiune de „plug and play”, ci trebuie abordată într-o manieră sistematică pentru a obține parametri de succes într-un panou de colorare. Principiile de bază ale conceperii panoului funcționează cel mai bine pe baza unei cercetări înainte de utilizare. Cu alte cuvinte, pregătirea este esențială chiar de la începutul procesului de referire la indicele de colorare în ceea ce privește potrivirea eficientă a fluorochromilor în funcție de luminozitate5.

Citometrie în flux Sfat:

Dispuneți ceva timp pentru a înțelege nuanțele subtile ale citometrului de flux înainte de a vă proiecta panoul de anticorpi primari. Concentrați-vă asupra locului în care se pot face cele mai sensibile măsurători pe sistem. Există mai mult decât simpla intensitate fluorescentă.

Considerați înlocuirea cu un fluorocrom mai puțin luminos pentru a evita erorile de canal.

Aplicații comune ale metodologiei citometriei în flux

Citometria în flux este o componentă integrantă în mai multe domenii clinice, inclusiv în diagnosticare, planuri de tratament și boli sistemice, fie că sunt statice sau progresive. Pe măsură ce aflăm mai multe despre aplicațiile practice de utilizare a citometriei în flux, baza de cunoștințe se extinde și mai mult. Acum, mai mult ca niciodată, cercetătorii sunt foarte entuziasmați de posibilitatea de a afla mai multe despre complexitatea anumitor boli și afecțiuni. Aceasta a dus la o schimbare rapidă în diagnosticarea modelelor și a modificat drastic abordările medicale de tratare a bolilor, cum ar fi cancerul6.

Metodologia citometriei în flux este adesea implicată cu alte modele de testare cuprinzătoare, cum ar fi examinarea morfologică. În multe cazuri, neoplasmele hematologice descriu modificări morfologice specifice, iar citometria în flux oferă o mai mare specificitate și îi ajută pe patologi să extindă anomaliile tisulare sau alte boli avansate. Citometria în flux, în unele cazuri, poate pre-determina recurența cancerului înainte ca modificările morfologice să fie detectate7.

Câteva dintre aplicațiile majore utilizate în cadrul cadrelor clinice moderne, atât terapeutice cât și orientate spre cercetare, includ:

• Expresia proteinelor – în întreaga celulă, chiar și în nucleu
• Modificări post-translaționale ale proteinelor – include proteine scindate și fosforilate
• ARN – incluzând atât miARN, cât și transcripții de ARNm
• Starea de sănătate a celulelor-detectarea celulelor apoptotice sau a morții celulare
• Starea ciclului celular-furnizând un instrument puternic pentru a evalua celulele în faza G0/G1 față de faza S, G2 sau poliploidie, inclusiv analiza proliferării și activării celulare
• Identificarea și caracterizarea unor subseturi distincte de celule în cadrul unui eșantion eterogen – inclusiv distingerea celulelor cu memorie efectoare centrale de celulele T epuizate sau de celulele T reglatoare

Încheiere

Principiile de bază ale citometriei în flux s-au schimbat puțin în ultimul deceniu, dar aplicațiile acestei tehnologii au evoluat foarte mult. Bazele citometriei în flux au fost în concordanță cu funcția sa primară, care constă în interogarea cu un laser a celulelor individuale sau a particulelor dintr-un flux în timp ce celulele trec pe lângă un set de detectori staționari. Din ce în ce mai multe culori de fluorescență sunt detectate de citometre, alături de sortarea de mare viteză și funcția analitică8.

Citometria de flux joacă un rol integral în cercetarea în domeniul științelor moleculare și continuă să evolueze într-un ritm rapid. Există mai multe citometre de flux comerciale pe piață. Acestea tind să funcționeze pe același principiu de bază, dar există diferențe importante în ceea ce privește proiectarea lor și conceptele privind alinierea și integrarea altor componente.

În curând, la orizont, va fi introdusă o instrumentație 3D care va fi încorporată într-un instrument hibrid brevetat produs de NanoCellect Biomedical, WOLF Cell Sorter. De asemenea, putem aștepta cu nerăbdare dezvoltarea sondelor fluorescente cu spectru îngust, integrarea tehnicilor de biologie moleculară cu citometria în flux și evaluarea markerilor fără celule, cum ar fi citokinele, vor fi componente cheie în evoluția continuă a analizei prin citometrie în flux și a tehnologiei de testare celulară.

Surse:

1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221

2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/

3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959

4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26

5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250

6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/

7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/

8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543