Compararea cantității și calității ADN-ului prin colectarea de salivă în urma consumului de alimente și băuturi

Materiale și metode

Am obținut aprobarea comitetului instituțional de evaluare a protecției subiecților umani din cadrul Laboratorului de Cercetare al Forțelor Aeriene, cu numărul de protocol FWR20180101H. Subiecții au fost informați în mod individual și au semnat documentele de consimțământ, martori fiind o terță parte. S-au recoltat probe de la cinci subiecți folosind Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) și Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Toate probele colectate au fost recoltate în aceeași zi, cu cel puțin 30 de minute între fiecare colectare sau pe parcursul a 3 zile, din cauza constrângerilor de timp ale participanților. S-au colectat două tampoane pentru fiecare subiect; fiecare tampon a fost frecat de interiorul fiecărui obraz timp de 10-15 s. S-au colectat șase probe de salivă: conform instrucțiunilor producătorului, imediat după ce a băut apă, a luat prânzul, a băut o băutură răcoritoare carbogazoasă, a băut o băutură sportivă sau a băut cafea.

Tăvălugurile au fost extrase cu ajutorul Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre). Primul tampon a fost procesat ca atare, iar cel de-al doilea a fost purificat cu ajutorul sistemului Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI), folosind protocolul de microcentrifugare pentru purificarea ADN genomic din lizații de celule de culturi tisulare. Nu a existat nicio etapă de spălare a celulelor, deoarece probele erau deja în soluție. Probele de salivă au fost extrase folosind QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) cu protocolul de extracție a salivă modificat de producător.

Eșantioanele au fost cuantificate folosind NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) cu Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. NanoDrop a fost utilizat, de asemenea, pentru a evalua puritatea probelor prin compararea valorilor absorbției la 260 și 280 nm (A260/A280). Ambele au fost utilizate conform protocoalelor producătorului. Probele extrase, normalizate la 10 ng/μL pe baza concentrațiilor Qubit, au fost analizate cu ajutorul unui gel de agaroză E-Gel® Precast de 2% (Thermo Fisher Scientific). Bioanalizatorul Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) împreună cu High Sensitivity DNA Chip a fost utilizat pentru a determina calitatea ADN-ului extras.

Eșantioanele au fost apoi analizate pe sistemul Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) pentru a testa doi markeri genetici legați de alergiile la arahide: rs7192 și rs9275596 . Genotiparea cu setarea reacției în lanț a prepolimerazei (PCR) în rampă rapidă la 60 °C timp de 1 minut, un ciclu de menținere la 95 °C timp de 10 minute, 40 de cicluri de 95 °C timp de 15 s, apoi 60 °C timp de 1 minut și un post-PCR la 60 °C timp de 1 minut. S-a folosit TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Testele de polimorfism nucleotidic unic (SNP) au fost utilizate la jumătate din concentrația recomandată de producător. Volumul final a fost de 10 µL.

Rezultate

Metoda de extracție a tampoanelor cu ajutorul soluției QuickExtract a dus la obținerea unei cantități ridicate de ADN. Valorile ADN-ului obținut din tampon fără nicio altă prelucrare ulterioară au variat între 1,38 și 54,2 pg/µL, așa cum a fost determinat de Bioanalyzer (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Cu toate acestea, rezultate anterioare neraportate din laboratorul nostru au demonstrat că experimentele de secvențiere au fost inhibate atunci când bibliotecile au fost pregătite direct din extracțiile din soluția QuickExtract. Prin urmare, am purificat aceste probe utilizând un protocol de purificare pe coloană Wizard, scăzând concentrația, așa cum era de așteptat (variind de la 2,59 la 38,2 pg/µL), și îmbunătățind rapoartele A260/A280 pentru a se apropia mai mult de intervalul general acceptat (1,8-2,1).

Eșantioanele de salivă colectate conform protocolului producătorului și extrase cu ajutorul kitului QIAamp Blood DNA Kit au avut un interval de 1,01 ng/μL la 8,20 ng/μL. Puritatea indicată de măsurarea A260/A280 a fost de obicei în intervalul pentru ADN (a se vedea fișierul suplimentar 1: tabelul S1). Niciuna dintre probele de salivă colectate după ce subiecții au băut diverse băuturi sau au luat masa de prânz nu a prezentat concentrații de ADN și lecturi de puritate semnificativ diferite de cele colectate utilizând protocolul producătorului (30 de minute de post) (Fig. 1) (Fig. 1).

Eșantioanele extrase normalizate la 10 ng/μL, așa cum au fost determinate de citirile Qubit 4.0, au fost rulate pe un E-Gel de 2 % utilizând un ladder de 1 kb (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Ne așteptam să vedem o bandă spre partea superioară a gelului reprezentând o extracție de ADN cu greutate moleculară mare. Așa cum era de așteptat, ADN-ul extras din diferitele metode de colectare a salivei a avut o greutate moleculară ridicată. În ciuda faptului că au fost normalizate la o intrare de 10-ng/µL, cele mai multe dintre probele de tampoane nu au rezultat într-o bandă clară, sugerând fie prezența unor interferențe de sarcină, fie o altă problemă sistematică.

O analiză mai detaliată a mărimii și purității pe un Bioanalyzer a arătat că toate probele și toate condițiile aveau predominant ADN cu greutate moleculară ridicată și concentrații similare (Fig. 2). În afară de concentrația scăzută menționată anterior în urma purificării extracției de tampoane, nu există tendințe legate de condițiile de recoltare (mâncare sau băutură) în ceea ce privește calitatea, dimensiunea sau concentrația ADN-ului care să devină evidente atunci când se analizează semnalele electroferogramei. Se pare că există o schimbare în funcție de subiect, deși acest fenomen nu a fost urmărit mai departe.

În cele din urmă, am utilizat genotiparea SNP pentru a testa adecvarea ADN-ului extras pentru procesele moleculare din aval (Fig. 3). Toate probele extrase de la toți subiecții au reușit să producă cu succes rezultate utilizabile pentru genotiparea a două SNP-uri asociate cu alergiile la arahide , cu excepția uneia dintre probele de tampoane purificate (Subiectul 5B).

Discuție

Când se proiectează un studiu de cercetare genetică, un produs comercial sau o intervenție în domeniul sănătății, ușurința de utilizare și conformitatea utilizatorului final sunt două considerente esențiale. Dispozitivele de recoltare a sângelui care necesită înțepături cutanate pot avea o complianță mai scăzută din cauza aversiunii față de durere. În urma observațiilor din laboratorul nostru, am observat în mod anecdotic o rată de înscriere mai mică în studii atunci când diferența principală este puncția venoasă față de prelevarea de salivă. Nu am efectuat un studiu controlat pentru a investiga acest fenomen; mai degrabă, am ales să continuăm cu prelevarea de probe de salivă pe baza ușurinței de utilizare, a creșterii aparente a numărului de înscrieri și a tipului de studii de cercetare efectuate predominant în laboratorul nostru. Deoarece studiile noastre implică autoadministrarea prelevării de probe de salivă, am căutat să determinăm dacă există o cantitate și o calitate suficient de mare de ADN prezentă pentru a fi utilizată în aplicațiile moleculare din aval, în urma diferitelor condiții probabile de colectare pe teren, în primul rând a consumului de alimente și băuturi diferite. Proiectul studiului nu a fost conceput pentru comparații încrucișate între indivizi; mai degrabă, am căutat să comparăm variabilitatea intra-subiect a colectării de probe. Ținând cont de acest obiectiv, nu am observat nicio scădere semnificativă a cantităților de ADN cauzată de variația față de instrucțiunile producătorului de a posti timp de 30 de minute înainte de colectare.

Deși cantitatea de ADN este importantă, mai critică pentru tehnicile avansate de biologie moleculară este calitatea ADN-ului obținut. În studiul nostru, am constatat că recoltarea probelor de salivă după ce am mâncat și am băut nu a avut niciun impact asupra randamentului de ADN cu greutate moleculară mare. Un astfel de ADN este esențial pentru secvențierea de generație următoare, scanarea matricei și genotiparea PCR. Mai mult, un test experimental care utilizează două ținte genetice independente în genotiparea PCR a demonstrat că aceste probe se pretează la analize moleculare.

Scopul nostru intenționat cu acest studiu a fost de a vedea dacă calitatea și cantitatea de ADN din recoltarea de salivă cu ajutorul unui kit de recoltare a ADN-ului din salivă ar fi afectate de nerespectarea indicațiilor producătorului, adică de faptul de a bea sau de a mânca chiar înainte de recoltare. În concordanță cu ipoteza noastră, nu am observat o diferență în ceea ce privește cantitatea sau calitatea ADN-ului izolat.

Concluzie

Studiile genetice s-au extins dincolo de domeniul unui efort pur științific și sunt acum comune în rândul publicului consumator. Pentru a optimiza probele umane pentru aceste studii, producătorii se străduiesc să dezvolte metode de recoltare simple și robuste. Prelevarea de salivă este cea mai puțin invazivă dintre aceste metode, produce ADN de înaltă calitate și asigură o stabilitate excelentă a produsului. Studiul nostru privind ADN-ul obținut din salivă în urma consumului de diverse băuturi și/sau gustări a arătat că nu există o diferență semnificativă în ceea ce privește cantitatea și calitatea ADN-ului colectat cu ajutorul kitului de colectare a ADN-ului din salivă Isohelix GeneFiX (Isohelix) atunci când probele nu sunt colectate conform protocolului producătorului. Chiar dacă dimensiunea eșantionului din acest studiu este mică, observațiile din alte studii din laboratorul nostru sunt în concordanță cu rezultatele comparației noastre sistematice prezentate aici. Prin urmare, concluzionăm că recoltarea de salivă este o modalitate robustă și neinvazivă de a colecta probe atât în laborator, cât și pe teren, iar cerința de 30 de minute de abținere de la alimente și băuturi este un ideal și nu un absolut.

.