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O oxigênio (O2) é evoluído durante o transporte fotossintético de elétrons quando a água é dividida pelo complexo de evolução do oxigênio para fornecer prótons e elétrons à cadeia de elétrons cloroplásticos, gerando assim ATP e NADPH – a fonte de energia e reduzindo a energia para o metabolismo da planta. A maior parte desta energia química é utilizada para impulsionar o metabolismo do carbono fotossintético, que consiste na carboxilação do ribulose-1,5-bisfosfato (ciclo de redução do carbono fotossintético) e oxigenação (ciclo de oxidação do carbono fotossintético); com uma necessidade combinada de electrões = JA. São necessários quatro elétrons para cada O2 evoluído de modo que a produção bruta de O2 (GOP) esteja relacionada com o transporte linear de elétrons (J) de acordo com J/4. Quando o transporte linear de elétrons é usado apenas para conduzir a fixação de CO2, o consumo de O2 e a liberação de CO2 pela oxidação fotossintética de carbono e respiração mitocondrial é tal que a produção líquida de O2 (NOP) é igual à assimilação líquida de CO2 (Anet; desde que o quociente respiratório seja 1, mas ver Tcherkez et al, 2017).

Adicionalmente, os electrões podem ser usados para o transporte alternativo de electrões não cíclicos (ANCET), incluindo, por exemplo, a fotoredução do próprio O2 formando espécies reactivas de oxigénio (reacções Mehler-peroxidase ou “ciclo água-água”; Asada, 1999), anabolismo cloroplástico (por exemplo, lípidos; Stumpf et al, 1963), a redução do oxaloacetato ao malato (que é exportado para as mitocôndrias; Scheibe, 2004), e a assimilação de nitrogênio (Bloom et al., 1989). A ANCET foi formulada como hipótese tanto como forma de regular a relação ATP/NADPH para atender às mudanças nas demandas energéticas do metabolismo celular quanto como mecanismo para prevenir a fotodamagem através da utilização de excesso redutor quando a densidade do fluxo de fótons excede a demanda de energia da fixação de CO2 (por exemplo, sob alta irradiação, temperaturas frias, estresse hídrico fechando estômatos; por exemplo, Badger, 1985; Ort e Baker, 2002; Robinson, 1988). É importante ressaltar que não há evidências formais de como os fluxos de elétrons interagem, particularmente sob condições flutuantes de luz (Morales et al., 2018).

As ANCET permite que maiores taxas de transporte linear de elétrons sejam sustentadas, o transporte total de elétrons (Jt) será maior que JA. Por outro lado, o efeito sobre a absorção de O2 será dependente da via metabólica envolvida. Por exemplo, nas reações Mehler-peroxidase, não há alteração líquida no O2, de modo que o NOP permanecerá igual ao Anet. Mas na redução do nitrato, a relação entre a produção de O2 ligado ao N e o consumo de O2 é altamente dependente do aminoácido sintetizado (Noctor e Foyer, 1998). Neste caso, o NOP nem sempre será igual ao Anet porque o O2 e o CO2 podem não ser equilibrados no metabolismo (Skillman, 2008). Consequentemente, medições concomitantes dos fluxos de CO2 e O2 são importantes para a compreensão de como as plantas regulam o uso da energia luminosa, com diferentes destinos tendo resultados metabólicos muito diferentes.

As primeiras medições da evolução do O2 foram incapazes de distinguir o GOP da absorção de O2 (Hill, 1937). O método de espectrometria de massa estabelecido por Mehler e Brown (1952) resolveu este problema empregando traçadores de isótopos de O2 para monitorar independentemente os fluxos de 16O2 e 18O2. Neste método, 18O2 puro foi fornecido para o espaço de cabeça de gás de uma câmara fechada, e o declínio em 18O2 foi atribuído à captação de O2. O2 evoluído carrega a mesma composição isotópica que a água de onde é gerado; neste caso, o isótopo dominante na água era 16O (Fig. 1). A abordagem de 18O-rotulagem foi ainda aplicada aos discos foliares (ex. Tourneux e Peltier, 1995), folhas inteiras excisadas (ex. Volk e Jackson, 1972), e plantas inteiras (Gerbaud e André, 1980), iluminando o destino do O2 in vivo.

A limitação dos sistemas fechados de troca de gases é que as medições só podem ser realizadas por curtos períodos de tempo (segundos a minutos) antes que a concentração de CO2 se esgote. Consequentemente, o CO2:O2 não é constante, o que altera as taxas relativas de carboxilação e oxigenação de modo que as estimativas de absorção de GOP e O2 serão imprecisas. Esta limitação foi superada na abordagem de espectrometria de massa, substituindo o CO2 consumido através do influxo periódico de CO2 na câmara, permitindo a quantificação em estado estável e ampliando a capacidade de medir fluxos de O2 sob uma gama de condições e estados fisiológicos (Canvin et al., 1980). Ao mesmo tempo, estavam sendo feitos avanços no uso da fluorescência de clorofila, que fornece informações sobre o rendimento quântico das PSII (Baker, 2008). Genty et al. (1989) forneceram a ligação empírica entre a fluorescência e a taxa de transporte de elétrons, substituindo a necessidade de medir diretamente a evolução de O2. A fluorescência de clorofila é hoje uma das técnicas mais populares na fisiologia vegetal devido à sua facilidade de uso e custo relativamente baixo. Isto tem sido auxiliado pela capacidade de medição de fluorescência multiplex com troca de gás H2O e CO2 em instrumentos portáteis disponíveis comercialmente, abrindo a possibilidade de medir o funcionamento da planta fora do laboratório. Consequentemente, as medições in vivo de fluxos de O2 diminuíram substancialmente nos últimos 20 anos.

Neste número de Plant Physiology, Gauthier et al. (2018) nos lembram por que é tão importante retornar nossa atenção ao O2, fornecendo-nos um novo e elegante sistema de percurso aberto para medir fluxos de O2. Seu método é uma abordagem isotópica “inversa”, envolvendo 18O-rotulagem da água foliar ao invés do ar, de modo que a composição isotópica de O2 que se desenvolve durante a divisão da água tem uma assinatura muito diferente da do O2 ambiente (Fig. 1). O uso de enriquecimento considerável de 18O é imperativo, uma vez que a contribuição do NOP em um fundo de 21% de O2 é provável que seja da ordem de 0,05% (por exemplo, 100 μmol mol-1 NOP/210,000 μmol mol-1 ambiente O2), dificultando normalmente a detecção precisa de uma mudança em δ18O de O2 associado ao NOP no ar ao redor da folha.

O método permanece altamente técnico, exigindo o uso de três instrumentos de alta precisão. A composição isotópica e a concentração de CO2 e vapor de H2O são medidas por espectroscopia a laser, e o δ18O2 e o δO2/N2 (para estimar a concentração de O2) por espectrometria de massa. Uma câmara feita sob medida também é necessária para abrigar a folha excisada e sua fonte de água com 18O, o que ajuda a evitar vazamentos através das gaxetas ao redor do pecíolo. Importante, o sistema de troca de gás aberto melhora a capacidade de alcançar medições em estado estável, e rotular a água versus o uso de gás 18O2 puro resolve o problema da acessibilidade, o que tem limitado muito a adoção de sistemas abertos.

Embora a fluorescência de clorofila tenha se tornado a opção popular para medir a taxa de transporte de elétrons, ela não é isenta de suposições. Por exemplo, assume-se frequentemente que as folhas absorvem 84% dos fótons incidentes e que 50% desses fótons são absorvidos pela PSII; no entanto, nem sempre é esse o caso (Baker, 2008). Isto pode levar a uma superestimação da taxa de transporte de elétrons quando computados a partir da fluorescência em comparação com as medidas do GOP. Além disso, a determinação precisa de JA é particularmente relevante para a estimativa da condutividade da mesofila, que foi uma aplicação destacada por Gauthier et al. (2018). As reações Mehler-peroxidase, que mostraram variar de 0% a 30% (Driever e Baker, 2011), levariam a uma superestimação dos fluxos de elétrons associados aos ciclos fotossintéticos de redução/oxigenação de carbono em ambos os métodos. Contudo, a vantagem da abordagem de etiquetagem isotópica é que a contribuição da reacção de Mehler para a produção bruta de O2 pode ser quantificada através do acoplamento de medidas de GOP com NOP (por exemplo, Furbank et al., 1982; ver Fig. 1). Agora que temos uma capacidade renovada de medir fluxos de O2, essas suposições não devem ser ignoradas.

Além de entender o trade-off entre eficiência e fotoproteção para uma melhor produção agrícola (Murchie e Niyogi, 2011), os diferentes destinos dos elétrons têm implicações importantes para a compreensão dos fluxos globais de O2. Notavelmente, a captação de O2 associada à fotorrespiração, respiração mitocondrial e as reações Mehler-peroxidase têm diferentes fatores de fracionamento isotópico (Guy et al., 1993), de modo que a quantificação dos fluxos de vias individuais é necessária para restringir as estimativas da produção primária global a partir da informação de δ18O (Welp et al, 2011).

É tempo de revisitarmos a medição dos fluxos de O2, e o novo método desenvolvido por Gauthier et al. (2018) nos fornece a capacidade necessária para fazê-lo.