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DNEs EM REGULAMENTO TRANSCRITIONAL

DNEs também podem surgir no contexto da regulação transcripcional. Por exemplo, um DNE pode ser obtido removendo o domínio de transação de uma TF modular, deixando apenas o domínio de ligação do DNA. Este factor truncado pode comportar-se como um inibidor competitivo da transcrição. Isto é conhecido por ocorrer na natureza. Por exemplo, a proteína C/EBP em mamíferos é expressa como três polipéptidos alternativos. Os polipeptídeos mais longos contêm um domínio de ativação transcripcional N-terminal, enquanto a forma curta carece dele. Como as isoformas longas e curtas se juntam em homo e heterodímeros, estes últimos comportam-se como um DN natural (Zahnow et al., 1997). Este é também o caso dos Stats 5 e 6 em vertebrados, que são capazes de dimerizar. Seu processamento proteolítico em resposta a sinais fisiológicos leva à remoção do domínio de ativação terminal C e os converte em poderosos inibidores que regulam negativamente a transdução de sinal (Nakajima et al., 2003). Nas plantas, um grande número de proteínas MYB funciona como reguladores transcripcionais. Na Arabidopsis, proteínas contendo uma única repetição de ligação de DNA MYB mas sem o domínio da transdução estão envolvidas na especificação de aspectos do destino das células epidérmicas. Estas proteínas interagem com outras TFs, incluindo as proteínas bHLH, e devido à ausência de um domínio transactivador, comportam-se como DN e trans-DNs ao formar complexos inactivos (Ramsay e Glover, 2005).

Remoção do domínio de ligação do ADN também pode levar a DNEs. Isto acontece em bHLH TFs. Como observado acima, o gene Id-1 codifica um inibidor de DNE que ocorre naturalmente nesta família de TFs. Proteínas bHLH completas (com domínios de ligação e dimerização do ADN) podem ser expressas constitutivamente. Entretanto, a expressão regulada do Id-1, contendo apenas o domínio de dimerização, impõe regulação sobre a atividade da proteína de bHLH (Sun, 1994). Um fenômeno similar também é esperado nas plantas. Por exemplo, o genoma da Arabidopsis codifica ∼120 proteínas de bHLH previstas para ligar o DNA e 27 proteínas com uma região menos básica que a necessária para a ligação (Toledo-Ortiz et al., 2003). Estes HLH não ligados ao ADN podem funcionar como proteínas de Id animal, como reguladores negativos das proteínas de bHLH através da formação de heterodímeros incapazes de ligar o ADN (Toledo-Ortiz et al., 2003). Efeitos similares são esperados nas TFs pertencentes à família de domínio básico/zíper leucino (bZIP), que contêm um motivo de ligação de DNA básico, um domínio de dimerização do zíper leucino e domínios para transativação. A Arabidopsis codifica 67 proteínas bZIP, todas elas previstas para funcionar como homo e/ou heterodímeros (Deppmann et al., 2004). Algumas delas são muito pequenas e podem carecer de domínios de ativação. Em um exemplo clássico em plantas, Fukazawa et al. (2000) elucidaram a função da REPRESSÃO DE CRESCIMENTO DE BZIP TF (RSG) na sinalização da giberelina através do uso de uma forma DN de RSG, que não tinha um domínio de ativação transcripcional e, portanto, agiu para reprimir a função da proteína do tipo selvagem quando expressa no tabaco transgênico. Além disso, de acordo com o que foi dito na seção que trata de trans-DNs por superexpressão, os complexos de transcrição de DNA-proteína também são sensíveis ao equilíbrio da dosagem gênica (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Alterações deste equilíbrio pela diminuição ou aumento da expressão de uma TF em relação a outras envolvidas no mesmo complexo podem induzir fenótipos anormais.

Um modelo simples de ativação transcripcional pode ser usado para explorar algumas sutilezas quantitativas de mutações de DN neste contexto. Estudos de sistemas virais e Drosophila têm mostrado que a transcrição frequentemente exibe uma relação sigmoidal com respeito à concentração de um TF. No caso de um sistema respondendo a um único tipo de ativador (A), esta resposta sigmoidal pode ser dissecada em dois componentes principais: ligação cooperativa de A ao promotor (p) de um gene alvo e sinergia (Figura 6). A sinergia é o resultado das interacções concertadas entre as moléculas de A já ligadas ao promotor e a maquinaria transcripcional (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Considerar um promotor, p, contendo dois locais de ligação para A. Os mesmos locais de ligação também são reconhecidos pela variante a, que pode agir como um inibidor competitivo. Assumimos que pode haver cooperação durante a interação entre as moléculas A com o promotor. Isto também pode ser assim para as interações entre A, a, e o promotor. Uma possível fonte de cooperatividade foi mencionada acima (isto é, A tende a formar dímeros em solução, mas isto é realçado durante a ligação do DNA). Outra possibilidade é que os monômeros são incapazes de interagir em solução e que a interação de um monômero com o DNA leva a uma mudança alostérica que aumenta a afinidade de A para um monômero que entra. Também é possível, embora menos provável, que não haja interações A-A e que a ligação de um monômero ao DNA leve a uma mudança no local vizinho que aumente sua afinidade com um monômero recém-chegado. Seja como for, a cooperatividade significa que a reação pA + A = pAA ocorre mais rapidamente que p + A = pA.

Devido à existência de sinergia, a espécie molecular que mais contribui para a transcrição é o promotor ocupado por duas moléculas de ativador: pAA. Isto também significa que se a constante de afinidade para a associação entre o complexo pA e a polimerase for KpolA, o K para a associação de pAA e a polimerase será muito superior a 2K (da ordem de K2polA; ver Zlotnick, 1994). Para acomodar a actividade de transacção parcial neste modelo, iremos utilizar Kpola (para a reacção pa + pol) e Kpola2 (para paa + pol). Sob estas suposições, uma equação para a resposta transcripcional (TR) em função da concentração de A (e a) pode ser derivada como descrito por Veitia (2003) e Veitia e Nijhout (2006) (ver Materiais Suplementares online).

Com uma equação bastante simples em mãos, várias condições podem ser exploradas: (1) a situação do tipo selvagem A/A, (2) quando falta um alelo (A/-), e (3) quando há coexpressão de A e uma versão truncada e falta o domínio da transação. Neste último caso, podemos distinguir duas situações diferentes: (3a) quando a mutação de uma cooperativa é abolida ou (3b) quando A e uma cooperativa interage. Finalmente, podemos também explorar uma situação (4) onde a capacidade de transatividade de a é normal e a cooperatividade ausente, e (5) quando a cooperatividade é normal mas a capacidade de transatividade é parcial.

Figure 7 mostra que uma TR, em relação à saída máxima do promotor versus exibe uma relação sigmoidal, variando entre 0 e 1. Saturação reflete a resposta máxima do sistema, mas isto não implica que o promotor funcione apenas em saturação. De acordo com a figura, e em geral, os valores na curva para o heterozigoto A/- em qualquer ponto são inferiores aos de A/A (para cada valor de relativo , o heterozigoto A/- tem duas vezes menos em termos absolutos do que o tipo selvagem). Curiosamente, em baixas concentrações relativas de A, a mudança entre as curvas é muito pronunciada Y(A/-) é ∼25% de Y(A/A). Entretanto, como intuitivamente esperado, para valores altos de A, a saturação também é atingida em A/-. Se este sistema fosse normalmente funcional em baixas concentrações de A, um indivíduo A/- exibiria um fenótipo típico haploinsuficiente.

O que acontece em A/a quando falta o domínio de transação na ausência de cooperatividade? De acordo com a definição clássica de DN, a curva é menor em qualquer ponto do que a de A/-. No entanto, há uma tendência para atingir saturação com concentrações crescentes de A e a. Na verdade, A tende a ocupar preferencialmente o promotor, pois garante interações cooperativas com os monômeros A que chegam. No entanto, é aparente que o reconhecimento do promotor com baixa concentração de proteínas ocorre menos prontamente em A/a do que na condição de tipo selvagem. Na prática, um monômero truncado incapaz de assegurar interações cooperativas levará a um DNE fraco. A situação é completamente diferente no outro extremo, quando a cooperatividade entre A e a é totalmente mantida. Na verdade, o platô da curva para A/a é alcançado a TR = 0,25. Isto é esperado porque o pAA, que conduz a transcrição (ou seja, as contribuições do pAa e do paa são insignificantes), representa apenas 25% das espécies promotoras ocupadas em saturação.

Um exemplo potencial é fornecido por uma mutação artificial no TF FOXL2. Esta TF reprime o promotor do gene regulador agudo esteroidogênico humano, que contém múltiplos locais de ligação putativa. Uma versão do FOXL2 contendo o domínio de ligação do ADN mas sem o domínio C-terminal é capaz de induzir um DNE que prejudica a repressão transcripcional. No entanto, este efeito só é obtido quando a versão DN é muito mais fortemente expressa (5× e 10×) do que a proteína do tipo selvagem (Pisarska et al., 2004). Como descrito acima, isto pode ser devido à ausência de interações cooperativas entre as moléculas FOXL2 neste promotor.

Um exemplo mais revelador é fornecido na Figura 8, que representa a resposta de dois promotores diferentes contendo um ou dois locais de ligação para a TF PTX2a e sua versão DN, como descrito anteriormente (Saadi et al., 2003. Em quantidades baixas de DNA transfectante (0,05 μg na Figura 8), a resposta do promotor com dois locais é mais de duas vezes mais forte (ou seja, 3×) do que a resposta do promotor com apenas um local. Esta é a assinatura combinada de cooperatividade e sinergia. Além disso, em altas concentrações de construções transfectantes WT+DN, a TR do promotor com dois sites vinculados é ∼25% de resposta apenas do tipo selvagem. Isto é esperado porque em altas concentrações de dímeros de proteína podem ser pré-montados mesmo antes de alcançar o DNA alvo. Neste caso, apenas 25% dos dímeros serão normais. A queda no TR é menos dramática para o promotor com apenas um site de ligação (espera-se 50%). De um ponto de vista prático, para evitar ignorar um potencial DNE em experiências in vitro, baixas quantidades das construções WT+DN devem ser transfectadas com um excesso de promotor de reportagem para evitar a sua saturação pela forma selvagem. De forma mais geral, devem ser fornecidas curvas de resposta para diferentes concentrações de TF para tais experiências de transfecção.

Como esperado intuitivamente, quando a capacidade de transativação de um é normal e a cooperatividade ausente, aparece um DNE muito suave que leva a um comportamento próximo a um alelo nulo em um estado heterozigoto. O isolamento deste tipo de mutante é possível usando uma elegante tela genética de levedura descrita por Burz e Hanes (2001). Uma mutação pode afetar os níveis de cooperatividade de forma menos dramática. Um caso interessante surge quando a cooperatividade cai para aproximadamente um décimo do nível normal (de acordo com os parâmetros subjacentes aos resultados apresentados na Figura 7) e a capacidade de transativação é normal. Nestas condições, a variante a comporta-se como um alelo hipomórfico no homozigoto a/a e como um alelo nulo em A/a (ou seja, A/a = A/-; dados não mostrados). Isto realça novamente a falta de limites distintos entre os alelos hipomórficos, DN e nulos.

Quando há uma transação residual (isto é, 1<Kpola<KpolA) e a cooperatividade é normal, o platô em A/a não é alcançado em TR = 1, mas em um nível inferior. Alelos com capacidade de ativação parcial podem ser facilmente produzidos em alguns casos. O paradigma é fornecido com a levedura TF Gal4, que contém duas regiões ativadoras (ARI e ARII) envolvidas no recrutamento da maquinaria transcripcional. Deleções na região ácida ARII levam a uma diminuição da capacidade de transativação (Ptashne e Gann, 2002; Ptashne, 2007). Uma combinação de tal alelo com o tipo selvagem Gal4 deve comportar-se como descrito. Como mostrado na Figura 7, a curva para A/a cruza a de A/-. Assim, o mesmo alelo pode ser hipomórfico se o sistema funcionar a baixos níveis de saturação (antes das curvas se cruzarem) e pode ser DN em termos moleculares a concentrações mais elevadas de proteínas. Uma explicação intuitiva pode ser fornecida. Considere, por exemplo, uma proteína a que interage com a polimerase com, digamos, 90% da resistência do tipo selvagem. Para uma gama de concentrações, o heterozigoto A/a tenderá a comportar-se como A/A. Contudo, na saturação apenas 25% das espécies promotoras serão pAA, que interage com a polimerase com a força máxima. Em contraste, num heterozigoto A/-, em baixas concentrações proteicas é mais difícil ocupar o promotor, enquanto que na saturação 100% das espécies promotoras serão pAA. Assim, as curvas para A/a e A/- devem se cruzar em algum ponto.

Todos os promotores alvo dentro de uma célula não são igualmente sensíveis a uma TF DN. Quando há uma forte cooperatividade e sinergia, a sensibilidade de um promotor a uma proteína DN deve depender do número de locais de ligação no DNA. O caso mais simples de visualizar é quando falta um domínio de transacção, mas interage cooperativamente com A. Se a espécie promotora que conduz a transcrição é a que está completamente carregada com proteína do tipo selvagem, como acima assumido, a TR máxima pode ser calculada usando a fórmula (das probabilidades binomiais) dada nos Materiais Suplementares online. Para um promotor com dois locais de ligação idênticos, a TR máxima será de 25% em relação à saída da condição do tipo selvagem: para três locais de ligação, 12,5%, e para quatro locais de ligação, 6,25% (quando A e a são expressos em concentrações equimolares). Para situações mais complexas, a resposta não é intuitiva e requer a análise de modelos não abordados aqui.