Porównanie ilości i jakości DNA przy użyciu pobierania śliny po spożyciu żywności i napojów

Materiały i metody

Uzyskaliśmy zgodę od instytucjonalnej komisji przeglądowej Air Force Research Laboratory’s human subjects protection, numer protokołu FWR20180101H. Obiekty zostały poinformowane indywidualnie i podpisały dokumenty zgody, których świadkiem była osoba trzecia. Próbki pobrano od pięciu uczestników przy użyciu wacika do zbierania próbek Epicentre Catch-All™ (Epicentre, Madison, WI) i zestawu do zbierania DNA ze śliny Isohelix GeneFiX™ (Isohelix, Kent, UK). Wszystkie zebrane próbki zostały zebrane tego samego dnia z co najmniej 30 minutową przerwą między kolejnymi pobraniami lub w ciągu 3 dni, ze względu na ograniczenia czasowe uczestników. Zebrano dwa wymazy na uczestnika; każdy wymaz pocierano o wewnętrzną stronę każdego policzka przez 10-15 s. Zebrano sześć próbek plwociny: zgodnie z instrukcjami producenta, natychmiast po wypiciu wody, zjedzeniu obiadu, wypiciu gazowanego napoju bezalkoholowego, wypiciu napoju sportowego lub wypiciu kawy.

Wymazy zostały wyekstrahowane przy użyciu Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0 (Epicentre). Pierwszy wymaz został przetworzony tak jak jest, a drugi został oczyszczony przy użyciu Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) z zastosowaniem protokołu mikrowirówki do oczyszczania genomowego DNA z lizatów komórek hodowli tkankowej. Nie było etapu płukania komórek, ponieważ próbki były już w roztworze. Próbki plwociny zostały wyekstrahowane przy użyciu QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ze zmodyfikowanym przez producenta protokołem ekstrakcji śliny.

Próbki zostały określone ilościowo przy użyciu NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) z Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. NanoDrop był również używany do oceny czystości próbek poprzez porównanie wartości absorbancji przy 260 i 280 nm (A260/A280). Obie metody były stosowane zgodnie z protokołami producenta. Wyekstrahowane próbki, znormalizowane do 10 ng/μL w oparciu o stężenia Qubit, analizowano przy użyciu 2% E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific). Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) wraz z High Sensitivity DNA Chip został użyty do określenia jakości wyekstrahowanego DNA.

Próbki były następnie analizowane na Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) w celu zbadania dwóch markerów genetycznych związanych z alergią na orzeszki ziemne: rs7192 i rs9275596 . Genotypowanie z szybką rampą wstępną reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ustawioną na 60 °C przez 1 min, cykl wstrzymania 95 °C przez 10 min, 40 cykli 95 °C przez 15 s, następnie 60 °C przez 1 min oraz post-PCR w 60 °C przez 1 min. Użyto TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Testy do polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) stosowano w połowie stężenia zalecanego przez producenta. Objętość końcowa wynosiła 10 µL.

Wyniki

W wyniku zastosowania metody ekstrakcji wymazów przy użyciu roztworu QuickExtract uzyskano dużą ilość DNA. Wartości DNA uzyskane z wymazu bez dalszej obróbki wahały się od 1,38 do 54,2 pg/µL, jak określono w Bioanalizatorze (plik dodatkowy 1: Tabela S1). Jednak wcześniejsze nieopublikowane wyniki z naszego laboratorium wykazały, że eksperymenty sekwencjonowania zostały zahamowane, gdy biblioteki zostały przygotowane bezpośrednio z ekstrakcji roztworu QuickExtract. Dlatego oczyściliśmy te próbki za pomocą protokołu oczyszczania na kolumnie Wizard, zmniejszając stężenie, zgodnie z oczekiwaniami (w zakresie od 2,59 do 38,2 pg/µL), i poprawiając proporcje A260/A280, aby zbliżyć się do ogólnie przyjętego zakresu (1,8-2,1).

Próbki plwociny zebrane zgodnie z protokołem producenta i ekstrahowane za pomocą QIAamp Blood DNA Kit miały zakres od 1,01 ng/μL do 8,20 ng/μL. Czystość wskazana przez pomiar A260/A280 była zwykle w zakresie dla DNA (patrz plik dodatkowy 1: Tabela S1). Żadna z próbek plwociny pobranych po wypiciu przez badanych różnych napojów lub zjedzeniu obiadu nie wykazywała stężeń DNA i odczytów czystości znacząco różniących się od próbek pobranych zgodnie z protokołem producenta (30 min na czczo) (ryc. 1).

Ekstraktowane próbki znormalizowane do 10 ng/μL, jak określono przez odczyty Qubit 4.0, zostały uruchomione na 2% E-Gel przy użyciu drabiny 1-kb (plik dodatkowy 1: Figura S1). Spodziewaliśmy się zobaczyć pasmo w kierunku górnej części żelu reprezentujące ekstrakcję DNA o wysokiej masie cząsteczkowej. Zgodnie z oczekiwaniami, wyekstrahowane DNA z różnych metod pobierania śliny miało wysoką masę cząsteczkową. Pomimo normalizacji do wkładu 10-ng/µL, większość próbek wymazów nie dała wyraźnego pasma, co sugeruje albo obecność interferentów ładunku, albo jakiś inny problem systematyczny.

Bardziej szczegółowa analiza wielkości i czystości na Bioanalizatorze wykazała, że wszystkie próbki i wszystkie warunki mają głównie wysokocząsteczkowe DNA i podobne stężenia (Rys. 2). Inne niż wyżej wspomniane niskie stężenie po oczyszczeniu ekstrakcji wymazu, nie ma żadnych związanych z warunkami pobierania (jedzenie lub picie) trendów w jakości, rozmiarze lub stężeniu DNA, które stają się widoczne podczas analizy sygnałów elektrofereogramu. Wydaje się, że istnieje zmiana zależna od podmiotu, chociaż zjawisko to nie było dalej badane.

Na koniec zastosowaliśmy genotypowanie SNP, aby sprawdzić przydatność wyekstrahowanego DNA do dalszych procesów molekularnych (ryc. 3). Wszystkie wyekstrahowane próbki od wszystkich badanych były w stanie z powodzeniem uzyskać wyniki nadające się do genotypowania dwóch SNP związanych z alergią na orzeszki ziemne, z wyjątkiem jednej z oczyszczonych próbek wymazu (Obiekt 5B).

Dyskusja

Przy projektowaniu badań genetycznych, produktu komercyjnego lub interwencji w służbie zdrowia, użyteczność i zgodność użytkownika końcowego to dwa krytyczne czynniki. Urządzenia do pobierania krwi, które wymagają nakłuwania skóry, mogą mieć mniejszą zgodność z wymaganiami z powodu niechęci do bólu. Z obserwacji w naszym laboratorium wynika, że anegdotycznie zauważyliśmy mniejszą liczbę zgłoszeń do badań, w których główną różnicą jest nakłuwanie żyły w porównaniu z pobieraniem próbek śliny. Nie przeprowadziliśmy kontrolowanego badania, aby zbadać to zjawisko; zdecydowaliśmy się raczej na pobieranie próbek śliny, kierując się łatwością użycia, widocznym wzrostem liczby zapisów i rodzajem badań, które przeważnie przeprowadzamy w naszym laboratorium. Ponieważ nasze badania polegają na samodzielnym pobieraniu próbek śliny, chcieliśmy określić, czy ilość i jakość DNA jest wystarczająco wysoka, aby można było je wykorzystać w dalszych zastosowaniach molekularnych, w zależności od różnych prawdopodobnych warunków pobierania próbek w terenie, przede wszystkim od spożycia różnych pokarmów i napojów. Projekt badania nie był przeznaczony do porównań między osobnikami; raczej staraliśmy się porównać wewnątrzpodmiotową zmienność zbierania próbek. Mając ten cel na uwadze, nie zaobserwowaliśmy znaczącego spadku ilości DNA spowodowanego różnicą w stosunku do instrukcji producenta, aby pościć przez 30 min przed pobraniem.

Ale ilość DNA jest ważna, bardziej krytyczna dla zaawansowanych technik biologii molekularnej jest jakość uzyskanego DNA. W naszym badaniu stwierdziliśmy, że pobieranie próbek śliny po jedzeniu i piciu nie miało wpływu na wydajność wysokocząsteczkowego DNA. Takie DNA jest krytyczne dla sekwencjonowania następnej generacji, skanowania tablic i genotypowania PCR. Co więcej, test eksperymentalny wykorzystujący dwa niezależne cele genetyczne w genotypowaniu PCR wykazał, że próbki te nadają się do analiz molekularnych.

Naszym zamierzonym celem w tym badaniu było sprawdzenie, czy na jakość i ilość DNA ze śliny pobranej przez zestaw do pobierania DNA ze śliny będzie miało wpływ nieprzestrzeganie wskazówek producenta, tj. picie lub jedzenie tuż przed pobraniem. Zgodnie z naszą hipotezą, nie zaobserwowaliśmy różnicy w ilości lub jakości wyizolowanego DNA.

Wniosek

Badania genetyczne wyszły poza sferę czysto naukowego przedsięwzięcia i są obecnie powszechne wśród konsumentów. Aby zoptymalizować próbki ludzkie do tych badań, producenci dążą do opracowania prostych, solidnych metod pobierania próbek. Pobieranie próbek śliny jest najmniej inwazyjną z tych metod, daje wysokiej jakości DNA i zapewnia doskonałą stabilność produktu. Nasze badania DNA uzyskanego ze śliny po spożyciu różnych napojów i/lub przekąsek wykazały, że nie ma znaczącej różnicy w ilości i jakości DNA pobranego przy użyciu zestawu Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix), gdy próbki nie są pobierane zgodnie z protokołem producenta. Pomimo, że wielkość próbki w tym badaniu jest mała, obserwacje z innych badań w naszym laboratorium są zgodne z wynikami naszego systematycznego porównania przedstawionego tutaj. Stwierdzamy zatem, że pobieranie śliny jest solidnym, nieinwazyjnym sposobem zbierania próbek zarówno w laboratorium, jak i w terenie, a wymóg 30-minutowego powstrzymania się od jedzenia i picia jest ideałem, a nie absolutem.