PMC

Tlen (O2) powstaje podczas fotosyntetycznego transportu elektronów, gdy woda jest rozszczepiana przez kompleks rozwijający tlen, aby dostarczyć protony i elektrony do chloroplastycznego łańcucha elektronowego, generując w ten sposób ATP i NADPH – źródło energii i siłę redukującą dla metabolizmu roślin. Większość tej energii chemicznej jest wykorzystywana do napędzania fotosyntetycznego metabolizmu węgla, który składa się z karboksylacji rybulozy-1,5-bisfosforanu (fotosyntetyczny cykl redukcji węgla) i utleniania (fotosyntetyczny cykl utleniania węgla); z łącznym zapotrzebowaniem na elektrony = JA. Cztery elektrony są wymagane na każdy wyewoluowany O2, tak więc produkcja brutto O2 (GOP) jest związana z liniowym transportem elektronów (J) zgodnie z J/4. Gdy liniowy transport elektronów jest używany tylko do napędzania wiązania CO2, zużycie O2 i uwalnianie CO2 przez fotosyntetyczne utlenianie węgla i oddychanie mitochondrialne jest takie, że produkcja netto O2 (NOP) jest równa asymilacji netto CO2 (Anet; pod warunkiem, że iloraz oddechowy wynosi 1, ale zobacz Tcherkez i in, 2017).

Dodatkowo elektrony mogą być wykorzystane do alternatywnego niecyklicznego transportu elektronów (ANCET), w tym np. do fotoredukcji samego O2 tworzącego reaktywne formy tlenu (reakcje Mehler-peroksydaza lub „cykl woda-woda”; Asada, 1999), anabolizmu chloroplastów (np. lipidów; Stumpf i in., 1963), redukcja oksalooctanu do jabłczanu (który jest eksportowany do mitochondriów; Scheibe, 2004) i asymilacja azotu (Bloom i in., 1989). ANCET został uznany zarówno za sposób regulacji stosunku ATP/NADPH w celu zaspokojenia zmieniających się potrzeb energetycznych metabolizmu komórkowego, jak i za mechanizm zapobiegający fotouszkodzeniom poprzez wykorzystanie nadmiaru reduktantów, gdy gęstość strumienia fotonów przekracza zapotrzebowanie energetyczne wiązania CO2 (np. przy wysokim napromieniowaniu, niskich temperaturach, stresie wodnym zamykającym aparaty szparkowe; np. Badger, 1985; Ort i Baker, 2002; Robinson, 1988). Co ważne, nie ma formalnych dowodów na to, jak przepływy elektronów oddziałują na siebie, szczególnie w zmiennych warunkach świetlnych (Morales i in., 2018).

Jako że ANCET pozwala na podtrzymanie większych szybkości liniowego transportu elektronów, całkowity transport elektronów (Jt) będzie większy niż JA. I odwrotnie, wpływ na pobór O2 będzie zależał od zaangażowanej ścieżki metabolicznej. Na przykład, w reakcjach Mehlera-peroksydazy, nie ma zmiany netto w O2, więc NOP pozostanie równy Anet. Ale w redukcji azotanu, stosunek pomiędzy produkcją N-linked O2 i zużyciem O2 jest wysoce zależny od syntetyzowanego aminokwasu (Noctor i Foyer, 1998). W tym przypadku, NOP nie zawsze będzie równy Anet, ponieważ O2 i CO2 mogą nie być zrównoważone w metabolizmie (Skillman, 2008). W związku z tym, równoczesne pomiary strumieni CO2 i O2 są ważne dla zrozumienia, jak rośliny regulują wykorzystanie energii świetlnej, z różnych losów o bardzo różnych wyników metabolicznych.

Najwcześniejsze pomiary ewolucji O2 nie były w stanie odróżnić GOP od poboru O2 (Hill, 1937). Metoda spektrometrii masowej ustanowiona przez Mehlera i Browna (1952) rozwiązała ten problem poprzez zastosowanie znaczników izotopów O2 do niezależnego monitorowania strumieni 16O2 i 18O2. W tej metodzie, czysty 18O2 był dostarczany do przestrzeni gazowej zamkniętej komory, a spadek 18O2 był przypisywany absorpcji O2. Wyewoluowany O2 ma taki sam skład izotopowy jak woda, z której powstał; w tym przypadku dominującym izotopem w wodzie był 16O (Rys. 1). Metoda znakowania 18O została następnie zastosowana do dysków liściowych (np. Tourneux i Peltier, 1995), całych wyciętych liści (np. Volk i Jackson, 1972) i całych roślin (Gerbaud i André, 1980), naświetlając los O2 in vivo.

Ograniczeniem zamkniętych systemów wymiany gazowej jest to, że pomiary mogą być wykonywane tylko przez krótkie okresy czasu (sekundy do minut), zanim stężenie CO2 zostanie wyczerpane. W konsekwencji, CO2:O2 nie jest stały, co zmienia względne tempo karboksylacji i natleniania, tak że szacunki poboru GOP i O2 będą niedokładne. Ograniczenie to zostało przezwyciężone w metodzie spektrometrii masowej poprzez zastąpienie CO2 zużytego przez okresowy napływ CO2 do komory, co pozwoliło na kwantyfikację w stanie ustalonym i rozszerzyło możliwości pomiaru strumienia O2 w różnych warunkach i stanach fizjologicznych (Canvin i in., 1980). W tym samym czasie poczyniono postępy w wykorzystaniu fluorescencji chlorofilu, która dostarcza informacji o wydajności kwantowej PSII (Baker, 2008). Genty et al. (1989) stworzyli empiryczny związek pomiędzy fluorescencją a szybkością transportu elektronów, zastępując potrzebę bezpośredniego pomiaru ewolucji O2. Fluorescencja chlorofilu jest obecnie jedną z najbardziej popularnych technik w fizjologii roślin ze względu na łatwość użycia i stosunkowo niski koszt. Pomogła w tym możliwość multipleksowania pomiarów fluorescencji z wymianą gazową H2O i CO2 w przenośnych, komercyjnie dostępnych urządzeniach, otwierając możliwość pomiaru funkcji roślin poza laboratorium. W konsekwencji, pomiary in vivo strumieni O2 znacznie zmniejszyły się w ciągu ostatnich 20 lat.

W tym numerze Plant Physiology, Gauthier i wsp. (2018) przypominają nam, dlaczego tak ważne jest, aby zwrócić naszą uwagę na O2, dostarczając nam nowy, elegancki system otwartej ścieżki do pomiaru strumieni O2. Ich metoda jest „odwrotnym” podejściem izotopowym, obejmującym znakowanie 18O wody w liściach, a nie w powietrzu, tak że skład izotopowy O2, który jest ewoluowany podczas rozszczepiania wody, ma sygnaturę bardzo różną od O2 z otoczenia (ryc. 1). Zastosowanie znacznego wzbogacenia 18O jest konieczne, ponieważ udział NOP w tle 21% O2 może być rzędu 0.05% (np. 100 μmol mol-1 NOP/210,000 μmol mol-1 otoczenia O2), co utrudnia zwykle dokładne wykrycie zmiany w δ18O O2 związanego z NOP w powietrzu otaczającym liść.

Metoda pozostaje wysoce techniczna, wymagająca użycia trzech wysoce precyzyjnych instrumentów. Skład izotopowy i stężenie CO2 i pary H2O są mierzone przez spektroskopię laserową, a δ18O2 i δO2/N2 (w celu oszacowania stężenia O2) przez spektrometrię masową. Wykonana na zamówienie komora jest również wymagana do przechowywania wyciętego liścia i źródła wody znakowanej 18O, co pomaga zapobiegać przeciekom przez uszczelki z okolic ogonka. Co ważne, otwarty system wymiany gazowej poprawia zdolność do osiągnięcia pomiarów w stanie ustalonym, a znakowanie wody w porównaniu do użycia czystego gazu 18O2 rozwiązuje problem przystępności cenowej, która znacznie ograniczyła przyjęcie systemów otwartych.

Choć fluorescencja chlorofilu stała się popularną opcją do pomiaru szybkości transportu elektronów, nie jest ona pozbawiona założeń. Na przykład, często zakłada się, że liście absorbują 84% padających fotonów i że 50% tych fotonów jest absorbowanych przez PSII; jednak nie zawsze tak jest (Baker, 2008). Może to prowadzić do przeszacowania szybkości transportu elektronów, gdy jest ona obliczana na podstawie fluorescencji w porównaniu z pomiarami GOP. Ponadto, dokładne określenie JA jest szczególnie istotne dla oszacowania przewodnictwa mezofilu, co było jednym z zastosowań podkreślonych przez Gauthier et al. (2018). Reakcje Mehler-peroksydaza, które, jak wykazano, wahają się od 0% do 30% (Driever i Baker, 2011), prowadziłyby do przeszacowania strumieni elektronów związanych z cyklami fotosyntetycznej redukcji/utleniania węgla w obu metodach. Jednakże zaletą metody znakowania izotopowego jest to, że udział reakcji Mehlera w produkcji brutto O2 może być określony ilościowo poprzez sprzężenie pomiarów GOP z NOP (np. Furbank i in., 1982; patrz Rys. 1). Teraz, gdy mamy odnowioną zdolność do mierzenia strumieni O2, te założenia nie powinny być ignorowane.

Poza zrozumieniem kompromisu między wydajnością i fotoprotekcją dla ulepszonej produkcji rolnej (Murchie i Niyogi, 2011), różne losy elektronów mają ważne implikacje dla zrozumienia globalnych strumieni O2. W szczególności, pobór O2 związany z fotorespiracją, oddychaniem mitochondrialnym i reakcjami Mehlera-peroksydazy mają różne współczynniki frakcjonowania izotopów (Guy i in., 1993), tak że kwantyfikacja indywidualnych strumieni ścieżek jest potrzebna do ograniczenia szacunków globalnej produkcji pierwotnej z informacji δ18O (Welp i in., 2011).

Najwyższy czas, abyśmy ponownie przyjrzeli się pomiarom strumieni O2, a nowa metoda opracowana przez Gauthier et al. (2018) zapewnia nam niezbędne możliwości, aby to zrobić.