PMC

DNEs IN TRANSCRIPTIONAL REGULATION

DNEs również mogą powstawać w kontekście regulacji transkrypcji. Na przykład, DNE można uzyskać poprzez usunięcie domeny transaktywacyjnej modularnego TF, pozostawiając jedynie domenę wiążącą DNA. Taki okrojony czynnik może zachowywać się jak konkurencyjny inhibitor transkrypcji. Wiadomo, że taka sytuacja występuje w przyrodzie. Na przykład, białko C/EBP u ssaków jest wyrażane jako trzy alternatywne polipeptydy. Dłuższe polipeptydy zawierają N-końcową domenę aktywacji transkrypcyjnej, podczas gdy krótka forma jest jej pozbawiona. Ponieważ izoformy długa i krótka łączą się w homo- i heterodimery, ta ostatnia zachowuje się jak naturalny DN (Zahnow i in., 1997). Podobnie jest w przypadku Stats 5 i 6 u kręgowców, które są zdolne do dimeryzacji. Ich proteolityczne przetwarzanie w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne prowadzi do usunięcia C-końcowej domeny aktywacyjnej i przekształca je w silne inhibitory, które negatywnie regulują transdukcję sygnału (Nakajima i in., 2003). W ro¶linach duża liczba białek MYB pełni funkcję regulatorów transkrypcji. W Arabidopsis, białka zawieraj±ce pojedyncze powtórzenie MYB wi±ż±ce DNA, ale pozbawione domeny transaktywacyjnej, zaangażowane s± w specyfikację losów komórek epidermy. Białka te oddziałują z innymi TF, w tym z białkami bHLH, a ze względu na brak domeny transaktywacyjnej zachowują się jak DN i trans-DN, tworząc nieaktywne kompleksy (Ramsay i Glover, 2005).

Usunięcie domeny wiążącej DNA może również prowadzić do powstania DNE. Zdarza się to w TF-ach bHLH. Jak wspomniano powyżej, gen Id-1 koduje naturalnie występujący inhibitor DN tej rodziny TFs. Kompletne białka bHLH (z domenami wiążącymi DNA i dimeryzującymi) mogą ulegać konstytutywnej ekspresji. Natomiast regulowana ekspresja Id-1, zawieraj±cego jedynie domenę dimeryzacyjn±, narzuca regulację aktywno¶ci białek bHLH (Sun, 1994). Podobnego zjawiska należy się spodziewać również u roślin. Na przykład, genom Arabidopsis koduje ∼120 białek bHLH przewidywanych do wiązania DNA i 27 białek z regionem podstawowym mniejszym niż wymagany do wiązania (Toledo-Ortiz i in., 2003). Te nie wi±ż±ce DNA białka HLH mog± funkcjonować podobnie jak zwierzęce białka Id, jako negatywne regulatory białek bHLH poprzez tworzenie heterodimerów niezdolnych do wi±zania DNA (Toledo-Ortiz i in., 2003). Podobnych efektów oczekuje się od TF należ±cych do rodziny basic domain/leucine zipper (bZIP), które zawieraj± podstawowy motyw wi±ż±cy DNA, domenę dimeryzacyjn± leucynowego zippera oraz domeny transaktywacyjne. Arabidopsis koduje 67 białek bZIP, z których wszystkie mają funkcjonować jako homo- i/lub heterodimery (Deppmann i in., 2004). Niektóre z nich są bardzo małe i mogą być pozbawione domen aktywujących. W klasycznym przykładzie roślinnym, Fukazawa i wsp. (2000) wyjaśnili funkcję bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) w sygnalizacji giberelinowej poprzez wykorzystanie formy DN RSG, która nie posiadała domeny aktywacji transkrypcyjnej i dlatego działała represyjnie w stosunku do białka typu dzikiego, gdy ulegało ekspresji w transgenicznym tytoniu. Ponadto, zgodnie z tym, co zostało powiedziane w części dotyczącej trans-DN poprzez nadekspresję, kompleksy transkrypcyjne DNA-białko są również wrażliwe na równowagę w dawkowaniu genów (Birchler i in., 2001; Veitia, 2002). Zmiany tej równowagi poprzez zmniejszoną lub zwiększoną ekspresję jednego TF w stosunku do innych zaangażowanych w ten sam kompleks mogą wywoływać nieprawidłowe fenotypy.

Prosty model aktywacji transkrypcyjnej może być użyty do zbadania niektórych ilościowych subtelności mutacji DN w tym kontekście. Badania systemów wirusowych i Drosophila wykazały, że transkrypcja często wykazuje sigmoidalną zależność w odniesieniu do stężenia TF. W przypadku systemu reagującego na jeden typ aktywatora (A), ta sigmoidalna odpowiedź może być podzielona na dwa główne składniki: kooperatywne wiązanie A z promotorem (p) genu docelowego i synergię (Rysunek 6). Synergia jest wynikiem zgodnych interakcji pomiędzy cząsteczkami A już związanymi z promotorem i maszynerią transkrypcyjną (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Rozważmy promotor, p, zawierający dwa miejsca wiążące dla A. Te same miejsca wiążące są również rozpoznawane przez wariant a, który może działać jako konkurencyjny inhibitor. Zakładamy, że może istnieć kooperatywność podczas oddziaływań pomiędzy cząsteczkami A a promotorem. Może tak być również w przypadku oddziaływań pomiędzy A, a i promotorem. Jedno z możliwych źródeł kooperatywności zostało wspomniane powyżej (tzn. A ma tendencję do tworzenia dimerów w roztworze, ale jest to wzmocnione podczas wiązania DNA). Inna możliwość jest taka, że monomery nie są w stanie oddziaływać w roztworze i że interakcja jednego monomeru z DNA prowadzi do zmiany allosterycznej, która zwiększa powinowactwo związanego A do przychodzącego monomeru. Jest też możliwe, choć mniej prawdopodobne, że nie ma oddziaływań A-A i że związanie jednego monomeru z DNA prowadzi do zmiany w sąsiednim miejscu, która zwiększa jego powinowactwo do nowo przybyłego monomeru. Niezależnie od tego, kooperatywność oznacza, że reakcja pA + A = pAA zachodzi łatwiej niż p + A = pA.

Dzięki istnieniu synergizmu, gatunkiem molekularnym, który najbardziej przyczynia się do transkrypcji jest promotor zajęty przez dwie cząsteczki aktywatora: pAA. Oznacza to również, że jeśli stała powinowactwa dla asocjacji pomiędzy kompleksem pA i polimerazą wynosi KpolA, to K dla asocjacji pAA i polimerazy będzie znacznie wyższe niż 2K (rzędu K2polA; patrz Zlotnick, 1994). Aby uwzględnić w tym modelu częściową aktywność transaktywacyjną, będziemy używać Kpola (dla reakcji pa + pol) i Kpola2 (dla paa + pol). Przy tych założeniach, równanie dla odpowiedzi transkrypcyjnej (TR) jako funkcji stężenia A (i a) może być wyprowadzone w sposób opisany przez Veitia (2003) oraz Veitia i Nijhout (2006) (patrz Supplemental Materials online).

Mając w ręku dość proste równanie, można zbadać kilka warunków: (1) sytuacja typu dzikiego A/A, (2) gdy występuje brakujący allel (A/-), oraz (3) gdy występuje koekspresja A i okrojonej wersji a pozbawionej domeny transaktywacyjnej. W tym ostatnim przypadku możemy wyróżnić dwie różne sytuacje: (3a) gdy mutacja a znosi kooperatywność lub (3b) gdy A i a oddziałują kooperatywnie. Wreszcie, możemy również zbadać sytuację (4), gdy zdolność transaktywacyjna a jest normalna, a kooperatywność nieobecna, oraz (5), gdy kooperatywność jest normalna, ale zdolność transaktywacyjna jest częściowa.

Rysunek 7 pokazuje, że TR, w stosunku do maksymalnej mocy wyjściowej promotora versus wykazuje zależność sigmoidalną, mieszczącą się w zakresie od 0 do 1. Nasycenie odzwierciedla maksymalną odpowiedź systemu, ale nie oznacza to, że promotor funkcjonuje tylko w stanie nasycenia. Zgodnie z rysunkiem, i ogólnie, wartości na krzywej dla heterozygoty A/- w każdym punkcie są niższe niż u A/A (dla każdej wartości względnej , heterozygota A/- ma dwa razy mniej w wartościach bezwzględnych niż typ dziki). Co ciekawe, przy niskich względnych stężeniach A, przesunięcie między krzywymi jest bardzo wyraźne Y(A/-) wynosi ∼25% Y(A/A). Jednakże, jak intuicyjnie oczekiwano, dla wysokich wartości A, nasycenie jest osiągane również w A/-. Gdyby ten system był normalnie funkcjonalny przy niskich stężeniach A, osobnik A/- wykazywałby typowy fenotyp haploinsufficient.

Co się dzieje w A/a, gdy a brakuje domeny transaktywacyjnej przy braku kooperatywności? Zgodnie z klasyczną definicją DN, krzywa w każdym punkcie jest niższa niż w przypadku A/-. Jednakże, istnieje tendencja do osiągania nasycenia wraz ze wzrostem stężenia A i a. W rzeczywistości, A ma tendencję do preferencyjnego zajmowania promotora, ponieważ zapewnia kooperatywne oddziaływania z przychodzącymi monomerami A. Widoczne jest jednak, że rozpoznawanie promotora przy niskim stężeniu białka zachodzi mniej łatwo w przypadku A/a niż w warunkach typu dzikiego. W praktyce, obcięty monomer niezdolny do zapewnienia kooperatywnych oddziaływań będzie prowadził do słabego DNE. Sytuacja jest zupełnie inna na drugim biegunie, gdy kooperatywność pomiędzy A i a jest w pełni zachowana. Istotnie, plateau krzywej dla A/a osiągane jest przy TR = 0,25. Jest to oczekiwane, ponieważ pAA, który napędza transkrypcję (tj. wkład pAa i paa jest pomijalny), reprezentuje tylko 25% zajętego gatunku promotora w stanie nasycenia.

Potencjalnego przykładu dostarcza sztuczna mutacja w TF FOXL2. Ten TF represjonuje promotor ludzkiego steroidogennego ostrego genu regulacyjnego, który zawiera wiele przypuszczalnych miejsc wiązania. Wersja FOXL2 zawierająca domenę wiążącą DNA, ale pozbawiona domeny C-końcowej, jest zdolna do indukowania DNE, która upośledza represję transkrypcyjną. Efekt ten jest jednak osiągany tylko wtedy, gdy wersja DN ulega znacznie silniejszej ekspresji (5× i 10×) niż białko typu dzikiego (Pisarska i in., 2004). Jak przedstawiono powyżej, może to wynikać z braku kooperatywnych oddziaływań pomiędzy cząsteczkami FOXL2 na tym promotorze.

Bardziej wymowny przykład przedstawiono na Rysunku 8, który przedstawia odpowiedź dwóch różnych promotorów zawierających jedno lub dwa miejsca wiążące dla TF PTX2a i jego wersji DN, jak opisano wcześniej (Saadi i in., 2003. Przy niskich ilościach transfekowanego DNA (0,05 μg na Rysunku 8), odpowiedź promotora z dwoma miejscami jest ponad dwukrotnie silniejsza (tj. 3×) niż odpowiedź promotora z tylko jednym miejscem. Jest to połączona sygnatura kooperatywności i synergizmu. Co więcej, przy wysokich stężeniach transfekowanych konstruktów WT+DN, TR promotora z dwoma miejscami wiążącymi wynosi ∼25% odpowiedzi samego typu dzikiego. Jest to oczekiwane, ponieważ przy wysokim stężeniu białka dimery mogą być wstępnie zmontowane jeszcze przed dotarciem do docelowego DNA. W tym przypadku, tylko 25% dimerów będzie normalnych. Spadek TR jest mniej dramatyczny w przypadku promotora z tylko jednym miejscem wiążącym (oczekiwane 50%). Z praktycznego punktu widzenia, aby uniknąć przeoczenia potencjalnego DNE w eksperymentach in vitro, niewielkie ilości konstruktów WT+DN powinny być transfekowane z nadmiarem promotora reporterowego, aby uniknąć jego wysycenia przez formę dziką. Bardziej ogólnie, krzywe odpowiedzi dla różnych stężeń TF powinny być dostarczone dla takich eksperymentów transfekcyjnych.

Jak można się spodziewać intuicyjnie, gdy zdolność transaktywacyjna a jest normalna, a kooperatywność nieobecna, pojawia się bardzo łagodne DNE, które prowadzi do zachowania zbliżonego do allelu zerowego w stanie heterozygotycznym. Izolacja tego typu mutantów jest możliwa przy użyciu eleganckiego genetycznego screeningu drożdżowego opisanego przez Burz i Hanes (2001). Mutacja może wpływać na poziom kooperatywności w mniej dramatyczny sposób. Ciekawy przypadek pojawia się, gdy kooperatywność spada do około jednej dziesiątej normalnego poziomu (zgodnie z parametrami leżącymi u podstaw wyników przedstawionych na Rysunku 7), a zdolność transaktywacji jest normalna. W tych warunkach wariant a zachowuje się jak allel hipomorficzny w homozygocie a/a i jak allel zerowy w A/a (tj. A/a = A/-; dane nie pokazane). To ponownie podkreśla brak wyraźnych granic między allelami hipomorficznymi, DN i null.

Gdy istnieje szczątkowa transaktywacja (tj. 1<Kpola<KpolA) i kooperatywność jest normalna, plateau w A/a nie jest osiągane na TR = 1, ale na niższym poziomie. Allele o częściowej zdolności aktywacji mogą być w niektórych przypadkach łatwo produkowane. Paradygmatu dostarcza drożdżowy TF Gal4, który zawiera dwa regiony aktywujące (ARI i ARII) zaangażowane w rekrutację maszynerii transkrypcyjnej. Delecje w kwa¶nym regionie ARII prowadz± do obniżenia zdolno¶ci transaktywacyjnych (Ptashne i Gann, 2002; Ptashne, 2007). Połączenie takiego allelu z dzikim Gal4 powinno zachowywać się tak, jak opisano. Jak pokazano na Rysunku 7, krzywa dla A/a przecina krzywą dla A/-. Tak więc, ten sam allel może być hipomorficzny, jeśli system działa na niskich poziomach nasycenia (zanim krzywe się przetną) i może być DN w kategoriach molekularnych przy wyższych stężeniach białka. Można to wyjaśnić intuicyjnie. Rozważmy, na przykład, białko a, które oddziałuje z polimerazą z, powiedzmy, 90% siły dzikiego typu. W pewnym zakresie stężeń heterozygota A/a będzie miała tendencję do zachowywania się jak A/A. Jednakże, przy nasyceniu tylko 25% promotora będzie pAA, który oddziałuje z polimerazą z maksymalną siłą. Natomiast u heterozygoty A/-, przy niskich stężeniach białka trudniej jest zająć promotor, natomiast przy nasyceniu 100% gatunku promotora będzie stanowił pAA. Tak więc krzywe dla A/a i A/- muszą się w pewnym momencie przeciąć.

Wszystkie docelowe promotory w komórce nie są jednakowo wrażliwe na DN TF. Gdy istnieje silna kooperacja i synergizm, wrażliwość promotora na białko DN powinna zależeć od liczby miejsc wiążących na DNA. Najprostszym przypadkiem do zobrazowania jest sytuacja, gdy a nie posiada domeny transaktywacyjnej, ale oddziałuje kooperatywnie z A. Jeśli gatunek promotora, który napędza transkrypcję, jest tym w pełni obciążonym białkiem typu dzikiego, jak przyjęto powyżej, maksymalny TR można obliczyć za pomocą wzoru (prawdopodobieństwa dwumianowego) podanego w Suplemencie online. Dla promotora z dwoma identycznymi miejscami wiążącymi, maksymalny TR wyniesie 25% w odniesieniu do wyjściowego stanu dzikiego: dla trzech miejsc wiążących – 12,5%, a dla czterech miejsc wiążących – 6,25% (gdy A i a są wyrażone w równomolowych stężeniach). Dla bardziej złożonych sytuacji, odpowiedź nie jest intuicyjna i wymaga analizy modeli, którymi nie zajmujemy się tutaj.