Składniki podstawowego systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej są przedstawione na prostym schemacie na rysunku E.
Zbiornik przechowuje rozpuszczalnik . Pompa wysokociśnieniowa jest używana do wytwarzania i odmierzania określonego natężenia przepływu fazy ruchomej, zwykle mililitrów na minutę. Wtryskiwacz jest w stanie wprowadzić próbkę do stale płynącego strumienia fazy ruchomej, który przenosi próbkę do kolumny HPLC. Kolumna zawiera materiał chromatograficzny potrzebny do przeprowadzenia rozdziału. Materiał ten nazywany jest fazą stacjonarną, ponieważ jest on utrzymywany w miejscu przez okucia kolumny. Aby zobaczyć oddzielone pasma związków podczas ich elucji z kolumny HPLC, potrzebny jest detektor. Faza ruchoma opuszcza detektor i może być wysłana do odpadów lub zebrana, zgodnie z życzeniem. Gdy faza ruchoma zawiera wydzielone pasmo związku, HPLC umożliwia zebranie frakcji eluatu zawierającej ten oczyszczony związek do dalszych badań. Nazywa się to chromatografią preparatywną .
Należy pamiętać, że do połączenia elementów pompy, iniektora, kolumny i detektora używane są wysokociśnieniowe rurki i złączki, które tworzą przewody dla fazy ruchomej, próbki i oddzielonych pasm związków.
Rysunek E: System wysokosprawnej chromatografii cieczowej
Detektor jest podłączony do komputerowej stacji danych, elementu systemu HPLC, który rejestruje sygnał elektryczny potrzebny do wygenerowania chromatogramu na jego wyświetlaczu oraz do identyfikacji i ilościowego oznaczenia stężenia składników próbki (patrz rysunek F). Ponieważ charakterystyki związków próbki mogą być bardzo różne, opracowano kilka rodzajów detektorów. Na przykład, jeśli związek może absorbować światło ultrafioletowe, stosowany jest detektor absorbancji UV. Jeśli związek fluoryzuje, stosuje się detektor fluorescencji. Jeśli związek nie posiada żadnej z tych cech, stosuje się bardziej uniwersalny typ detektora, taki jak detektor ewaporacyjny rozpraszający światło. Najbardziej wydajnym podejściem jest zastosowanie wielu detektorów w układzie szeregowym. Na przykład, detektor UV i/lub ELSD może być użyty w połączeniu ze spektrometrem masowym do analizy wyników rozdzielania chromatograficznego. Zapewnia to, z pojedynczej iniekcji, bardziej wyczerpujące informacje o analicie. Praktykę sprzęgania spektrometru mas z systemem HPLC nazywa się LC/MS.
Rysunek F: Typowy system HPLC
Operacja HPLC
Prostym sposobem zrozumienia, w jaki sposób uzyskujemy rozdział związków zawartych w próbce, jest obejrzenie schematu na rysunku G.
Faza ruchoma wchodzi do kolumny z lewej strony, przechodzi przez złoże cząstek i wychodzi z prawej strony. Kierunek przepływu jest przedstawiony za pomocą zielonych strzałek. Po pierwsze, rozważmy górny obraz; przedstawia on kolumnę w czasie zerowym , kiedy próbka wchodzi do kolumny i zaczyna tworzyć pasmo. Przedstawiona próbka, mieszanina żółtych, czerwonych i niebieskich barwników, pojawia się na wlocie kolumny jako pojedyncze czarne pasmo.
Po kilku minutach, podczas których faza ruchoma przepływa w sposób ciągły i jednostajny obok cząstek materiału uszczelniającego, możemy zauważyć, że poszczególne barwniki przemieszczają się w oddzielnych pasmach z różnymi prędkościami. Dzieje się tak dlatego, że istnieje konkurencja pomiędzy fazą ruchomą a fazą stacjonarną o przyciąganie każdego z barwników lub analitów. Zauważ, że pasmo żółtego barwnika porusza się najszybciej i jest bliskie opuszczenia kolumny. Żółty barwnik lubi fazę ruchomą bardziej niż inne barwniki. Dlatego porusza się on z większą prędkością, bliżej fazy ruchomej. Niebieskie pasmo barwnika bardziej lubi materiał opakowania niż fazę ruchomą. Jego silniejsze przyciąganie do cząsteczek powoduje, że porusza się on znacznie wolniej. Innymi słowy, jest to najbardziej zatrzymany związek w tej mieszaninie próbek. Czerwone pasmo barwnika ma pośrednie przyciąganie do fazy ruchomej i dlatego porusza się z pośrednią prędkością przez kolumnę. Ponieważ każde pasmo barwnika porusza się z inną prędkością, jesteśmy w stanie rozdzielić je chromatograficznie.
Rysunek G: Zrozumienie działania kolumny chromatograficznej – pasma
Co to jest detektor?
Jak rozdzielone pasma barwnika opuszczają kolumnę, przechodzą natychmiast do detektora. Detektor zawiera komórkę przepływową, która widzi każde oddzielone pasmo związku na tle fazy ruchomej. Odpowiedni detektor ma zdolność wyczuwania obecności związku i wysyłania odpowiadającego mu sygnału elektrycznego do komputerowej stacji danych. Wybór jest dokonywany spośród wielu różnych typów detektorów, w zależności od charakterystyki i stężenia związków, które muszą być rozdzielone i przeanalizowane, jak omówiono wcześniej.
Co to jest chromatogram?
Chromatogram jest reprezentacją rozdzielenia, które chemicznie nastąpiło w systemie HPLC. Seria pików wzrastających od linii podstawowej jest rysowana na osi czasu. Każdy pik reprezentuje odpowiedź detektora dla innego związku. Chromatogram jest wykreślany przez komputerową stację danych .
Rysunek H: Jak powstają piki
Na rysunku H, żółte pasmo całkowicie przeszło przez komórkę przepływową detektora; wygenerowany sygnał elektryczny został przesłany do komputerowej stacji danych. Wynikowy chromatogram zaczął się pojawiać na ekranie. Należy zauważyć, że chromatogram rozpoczyna się w momencie pierwszego wstrzyknięcia próbki i zaczyna się jako linia prosta umieszczona blisko dolnej części ekranu. Jest to tak zwana linia podstawowa; przedstawia ona czystą fazę ruchomą przechodzącą przez komórkę przepływową w czasie. W miarę jak żółte pasmo analitu przechodzi przez kuwetę przepływową, do komputera wysyłany jest silniejszy sygnał. Linia zakrzywia się, najpierw w górę, a następnie w dół, proporcjonalnie do stężenia żółtego barwnika w paśmie próbki. W ten sposób na chromatogramie powstaje pik. Po całkowitym wyjściu żółtego pasma z celi detektora poziom sygnału powraca do wartości wyjściowej; w celi przepływowej znajduje się teraz ponownie tylko czysta faza ruchoma. Ponieważ żółte pasmo porusza się najszybciej, eluując jako pierwsze z kolumny, jest ono pierwszym wykreślonym pikiem.
Chwilę później do celi przepływowej dociera czerwone pasmo. Sygnał wzrasta od linii podstawowej, gdy czerwone pasmo po raz pierwszy wchodzi do kuwety, a pik reprezentujący czerwone pasmo zaczyna być rysowany. Na tym wykresie czerwone pasmo nie przeszło jeszcze w pełni przez komórkę przepływową. Wykres pokazuje, jak wyglądałaby czerwona wstęga i czerwony pik, gdybyśmy zatrzymali proces w tym momencie. Ponieważ większość czerwonego pasma przeszła przez kuwetę, większość piku została narysowana, jak pokazuje linia ciągła. Gdybyśmy mogli ponownie rozpocząć proces, czerwone pasmo całkowicie przeszłoby przez kuwetę przepływową i czerwony pik zostałby ukończony. Niebieskie pasmo, najsilniej zatrzymane, przemieszcza się najwolniej i eluuje po pasmie czerwonym. Linia przerywana pokazuje, jak wyglądałby ukończony chromatogram, gdybyśmy pozwolili na kontynuowanie badania aż do jego zakończenia. Interesujące jest to, że szerokość niebieskiego piku będzie najszersza, ponieważ szerokość niebieskiego pasma analitu, podczas gdy jest najwęższe na kolumnie, staje się najszersze w miarę jego elucji z kolumny. Dzieje się tak dlatego, że porusza się on wolniej przez złoże chromatograficznego materiału uszczelniającego i wymaga więcej czasu, aby zostać całkowicie wymytym. Ponieważ faza ruchoma przepływa w sposób ciągły ze stałą szybkością, oznacza to, że niebieskie pasmo poszerza się i jest bardziej rozcieńczone. Ponieważ detektor reaguje proporcjonalnie do stężenia pasma, niebieski pik ma mniejszą wysokość, ale większą szerokość.