Enteropathogens associated with diarrheal disease in infants of poor urban areas of Porto Velho, Rondônia: a preliminary study

Enteropathogens Associated with Diarrheal Disease in Infants of Poor Urban Areas of Porto Velho, Rondônia: a Preliminary Study

Vol. 96(5): 621-625, Jul 2001

Patrícia Puccinelli Orlandi+, Tatiane Silva, Gleiciene Felix Magalhães, Fabiana Alves, Roberto Penna de Almeida Cunha, Rui Durlacher, Luiz Hildebrando Pereira da Silva

Centro de Pesquisa em Medicina Tropical, Rodovia BR 364, km 4.5, 78970-900 Porto Velho, RO, Brasil

Sto trzydzieści przypadków biegunki i 43 dopasowane wiekowo kontrole, w wieku od 0 do 5 lat, badano w pediatrycznej jednostce ambulatoryjnej z ubogiego obszaru okołomiejskiego Porto Velho, Rondônia. Osiemdziesiąt procent przypadków biegunki zaobserwowano w grupach poniżej 2 roku życia. Najczęstszym enteropatogenem związanym z biegunką był rotawirus (19,2%), a następnie Shigella flexneri (6,15%) i S. sonnei (1,5%) oraz Salmonella sp. (6,9%). Stwierdzono również cztery przypadki zakażeń enterotoksycznych E. coli (3,1%), enteropatogennych E. coli (EPEC)(2,3%), jeden przypadek zakażenia enteroinwazyjnego E. coli (0,8%) oraz jeden przypadek Yersinia enterocolitica (0,8%). Często występowały zakażenia mieszane, kojarzące rotawirusy, EPEC i Salmonella sp. z Entamoeba histolytica i Giardia lamblia.

Key words: diarrheal disease – enteropathogens – rotavirus infections – epidemiology – Rondônia – Brazil

Choroba biegunkowa jest przyczyną około pięciu milionów zgonów rocznie wśród niemowląt poniżej 5 roku życia na całym świecie (Georges i wsp. 1984). Główne czynniki ryzyka śmiertelności z powodu biegunki są dobrze znane i wiążą się z niską jakością życia, brakiem warunków sanitarnych i czystej wody dla większości populacji zamieszkującej ubogie obszary krajów rozwijających się.

Badanie podłużne przeprowadzone w latach 1990-1992 w mieście Belém, we wschodnim regionie Amazonii, wykazało 5,9 przypadków biegunki na dziecko/rok (Linhares 1997).

Mniej aktualne dane z Fortalezy, w północno-wschodnim regionie kraju, wykazały, że liczba epizodów biegunki w grupie wiekowej od 6 do 12 miesięcy przekracza 7 i 9 na osobę rocznie wśród rodzin z biednych obszarów miejskich i biednych obszarów wiejskich, odpowiednio, zmniejszając się stopniowo do dwóch epizodów rocznie na osobę wśród dorosłych (Guerrant & Kirchhoff 1983). Do tej pory w Rondônii, jak również w zachodniej części Regionu Amazonki, nie przeprowadzono badań w celu ustalenia zapadalności na choroby biegunkowe, jednak dane z oficjalnej służby zdrowia wskazują, że biegunka jest główną przyczyną śmiertelności wśród dzieci w wieku od 0 do 5 lat (Plano Plurianual de Saúde de Rondônia 1996).

Wykonano wiele badań w południowych i południowo-wschodnich regionach Brazylii w celu zidentyfikowania czynników etiologicznych związanych z biegunką, a także w celu oceny zarówno epidemiologicznych, jak i klinicznych cech choroby (Riley i wsp. 1984, Trabulsi i wsp. 1985a, Gomes i wsp. 1991). Kilka badań przeprowadzono w regionie północno-wschodnim, szczególnie w Fortalezie (Guerrant & Kirchhoff 1983) i Recife (Leal et al. 1988). Nie przeprowadzono żadnych badań w północnym regionie Amazonii w Brazylii, z wyjątkiem specyficznych badań nad rotawirusami w Belém.

Przedstawiamy tutaj wstępne dane dotyczące etiologii i cech klinicznych biegunki u niemowląt w wieku od 0 do 5 lat, mieszkających w ubogim obszarze miejskim, które zostały skierowane do pediatrycznej jednostki ambulatoryjnej w Porto Velho, Rondônia (zachodni region Amazonii). Względne częstości występowania enteropatogenów są podobne do opisanych w północno-wschodnim regionie Brazylii.

MATERIAŁY I METODY

WYNIKI

DYSKUSJA

.

ACKNOWLEDGMENTS

MATERIAŁ I METODY

Obszar badań -. Badanie zostało przeprowadzone w okresie od lipca 1998 do marca 1999 przez pracowników „Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEPEM)”, Porto Velho, w ambulatoryjnej jednostce zdrowia „Policlínica Hamilton Gondin”. W Porto Velho, stolicy kraju, nastąpił znaczny wzrost liczby ludności w ciągu ostatnich trzech dekad, spowodowany migracją z różnych obszarów Brazylii po wybudowaniu drogi „BR364″, która łączy miasto z regionami Centralnym i Południowym kraju. Obecna populacja miasta wynosi około 200.000 mieszkańców. Miasto ma nowoczesny projekt geometryczny, ale brakuje odpowiedniego systemu sanitarnego. Policlínica” znajduje się w biednych północnych obrzeżach miasta. Zaopatrzenie w wodę pitną jest ograniczone do niewielkiego odsetka wiekowych rezydencji, a sieć kanalizacyjna jest nieobecna, każdy dom posiada pitne toalety.

Przegląd badania – Sto trzydzieści niemowląt w wieku od 0 do 5 lat zostało przywiezionych przez matki do „Polikliniki” z powodu choroby biegunkowej; ponadto do badania wybrano 43 dopasowane wiekowo niemowlęta kontrolne bez biegunki z „Polikliniki”. Pediatrzy z CEPEM przeprowadzili wywiad z towarzyszącymi im dorosłymi, uzyskali pisemną świadomą zgodę, wypełnili kwestionariusz i przeprowadzili badanie fizykalne. Szczególną uwagę zwrócono na historię objawów w przeszłości, liczbę epizodów biegunki, gorączkę (temperatura pachowa > 37o.8), wymioty, odwodnienie oraz obecność śluzu i krwi w stolcu.

Metody laboratoryjne – Próbki kału pobierano albo po naturalnej ewakuacji, albo poprzez stymulację czopkiem glicerynowym. Próbki dzielono na dwie frakcje: jedna frakcja była wykorzystywana do badań parazytologicznych i testów na obecność rotawirusów przy użyciu zestawu Slidex (Biomerieux). Drugą frakcję posiewano zgodnie ze standardowymi procedurami bakteriologicznymi. W skrócie, około 3 g kału zawieszano w 3 ml PBS i umieszczano na następujących podłożach selektywnych: MacConkey, SS i brilliant green agar (po wzbogaceniu w bulionie tetrationianowym zawierającym 40 µg/ml nowobiocyny) w celu izolacji i identyfikacji następujących bakterii enteropatogennych: enteropatogennych Escherichia coli (EPEC), enterokrwotocznych (wytwarzających toksynę Shiga-like) E. coli (EHEC), enteroinwazyjnych E. coli (EIEC), Shigella, Salmonella sp., Yersinia species, Campylobacter jejuni i C. coli. Płytki inkubowano w temperaturze 37oC przez 24-48 h, z wyjątkiem płytek używanych do identyfikacji gatunków Campylobacter; te wykrywano przy użyciu płytek ze zmodyfikowaną metodą Skirrow, a następnie inkubowano w temperaturze 42oC przez 48 h w słoiku Gaspak.

Pięć pozytywnych kolonii typowych dla E. coli i jedna kolonia laktozoujemna o różnych typach morfologicznych wyhodowanych na płytkach z agarem MacConkey, jak również kolonie laktozoujemne i laktozododatnie wyizolowane na płytkach z agarem SS i zielenią brylantową zostały zidentyfikowane testami biochemicznymi przy użyciu zestawu EPM millicitrate (ProBac, Brasil). Kolonie przypominające gatunki Campylobacter, rosnące na płytkach zmodyfikowanych metodą Skirrowa, poddano barwieniu metodą Grama oraz testom na katalazę i oksydazę w celu potwierdzenia rodzaju. Szczepy E. coli wyizolowane na podłożu MacConkey poddano testom aglutynacji szkiełkowej z użyciem poliwalentnych surowic przeciwko serogrupom A, B i C EPEC. Izolaty nie wykazujące aglutynacji testowano z surowicą przeciwko serogrupie O157 EHEC oraz z poliwalentnymi surowicami przeciwko serogrupom A i B EIEC. Izolaty zidentyfikowane na podstawie badań biochemicznych jako gatunki Shigella i Yersinia poddano serotypowaniu przy użyciu standardowych technik. Do oznaczania serotypów użyto komercyjnie dostępnych surowic odpornościowych firm ProBac i Promicro (São Paulo).

59 do 76 (ET-LT1,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

765 do 746 (ET-LT2,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

79 do 98 (ET-ST1,5’CTGTATTATTGTCTTTCACCT3′) i

260 do 241 (ET-ST2, 5’GCACCCGGTACAAGCAGGAT3′).

Amplifikację prowadzono przez 30 cykli w termocyklerze Perkin-Elmer, w następujący sposób: denaturacja przez 2 min w 92ºC, annealing przez 1 min w 50oC i przedłużenie przez 2 min w 72ºC. Proces amplifikacji kończył się 5-minutowym przedłużeniem w 72oC, a probówki były szybko chłodzone w 4oC. Piętnaście µl każdej próbki poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym nasyconym bromkiem etydyny przy napięciu 100V przez 2 h w celu wizualizacji produktu PCR.

WYNIKI

Rozkład grup wiekowych zachorowań na biegunki – Wśród 130 zachorowań na biegunki w „Poliklinice” zaobserwowano wyraźnie wyższą zapadalność w grupach wiekowych od 0 do 2 lat. Szczególnie dotknięte były niemowlęta poniżej 1 roku życia, na które przypadały 62 przypadki (47,7%), z których 28 (21,4%) miało mniej niż 6 miesięcy (Tabela I).

Występowanie enteropatogenów – Wśród 130 przypadków choroby biegunkowej, badania laboratoryjne były negatywne dla bakterii enteropatogennych i rotawirusów u 16 niemowląt. Tabela II przedstawia rozkład patogenów stwierdzonych w kale 53 niemowląt z biegunką (40,7%) i w 2 grupach kontrolnych (4,6%). Najczęstszym patogenem były rotawirusy (19,2% przypadków biegunki i 2,4% kontroli). Gatunki Shigella występowały w 10 przypadkach (7,7%) i nie występowały w grupie kontrolnej, z wysoką częstością S. flexneri (8/10) w stosunku do S. sonnei (2/10). Salmonella sp. stwierdzono w 9 przypadkach (6,9% biegunek i 1 kontrolnym – 2,4%). ETEC stwierdzono w 4 biegunkach, z których wszystkie posiadały enterotoksyny LT i ST. EPEC stwierdzono w 3 przypadkach biegunek (2 E. coli O111 i 1 E. coli O125). Wśród dzieci z biegunką zidentyfikowano jeden przypadek z EIEC i jeden z Y. enterocolitica. Campylobacter nie stwierdzono ani w przypadkach biegunki, ani w grupie kontrolnej. Badania parazytologiczne wykazały w 8 przypadkach choroby biegunkowej cysty E. histolytica. Cysty G. lamblia stwierdzono w 19 przypadkach biegunki i w 4 kontrolnych. Stosunkowo często występowały zakażenia mieszane o następującym rozkładzie: 2 przypadki zakażeń S. flexneri i rotawirusem; 3 przypadki zakażeń z udziałem Salmonella sp. i G. lamblia oraz 2 przypadki jednoczesnego zakażenia EPEC i E. histolytica.

Rozkłady wiekowe – Rozkład grup wiekowych różnych enteropatogenów stwierdzonych w związku ze 114 przypadkami choroby biegunkowej przedstawiono na rycinie. Jak już pokazano w tabeli I, 80,5% epizodów biegunki wystąpiło w grupach wiekowych poniżej 2 lat. Wskaźniki dodatniości rotawirusów są równie wysokie u niemowląt poniżej 1 roku życia, jak i w grupie wiekowej 1-2 lat. Inne patogeny występują we wszystkich grupach wiekowych, ale ich częstość nie może być określona ze względu na małą liczbę przypadków biegunki obserwowanych u dzieci powyżej 2 roku życia.

DYSKUSJA

W niniejszym badaniu, 130 przypadków biegunki i 43 dopasowane wiekowo grupy kontrolne w grupie wiekowej od 0 do 5 lat były badane w pediatrycznej jednostce ambulatoryjnej w obszarze podmiejskim Porto Velho. Przypadki biegunki koncentrowały się w grupach wiekowych poniżej 2 roku życia (80%), co sugeruje stopniowy rozwój odporności przeciwko enteropatogenom. Jednakże, ponieważ przypadki biegunki były wykrywane biernie, rodzicielskie i społeczne przyzwyczajenie do zwiększonej uwagi poświęcanej młodszym dzieciom może częściowo wyjaśniać tendencyjność obserwowaną w rozkładzie wieku przypadków. W badaniu podłużnym przeprowadzonym w Fortalezie, w którym aktywnie poszukiwano przypadków biegunki, zaobserwowano podobny rozkład wieku (Guerrant & Kirchhoff 1983), co potwierdza ważną rolę odporności w wyjaśnianiu profilu rozkładu wieku.

W odniesieniu do enteropatogenów związanych z epizodami biegunki, stwierdzono w próbce z Porto Velho wysoką częstość występowania rotawirusów (19,2% przypadków biegunki i 2,4% kontroli).

ETEC była najczęstszą podgrupą E. coli związaną z biegunką w badaniu Guerrantów w Fortalezie, podczas gdy była ona odpowiedzialna za mniejszy odsetek pacjentów w badaniu Trabulsi w São Paulo (Trabulsi i wsp. 1985b) i w obecnym badaniu w Porto Velho. Podczas gdy w próbkach z São Paulo i Fortalezy zawsze znajdowały się szczepy E. coli pozytywne pod względem toksyny LT, w czterech izolatach ETEC z Porto Velho stwierdzono obecność zarówno toksyn LT, jak i ST.

Zakażenia Salmonella i Shigella, rzadkie w badaniach w São Paulo (Gomes et al. 1991), są częstsze na północnym wschodzie (Guerrant & Kirchhoff 1983) i w Porto Velho, gdzie były związane odpowiednio z 6,9% i 7,7% epizodów choroby biegunkowej. Zakażenia Shigella, które są równie częste w innych krajach rozwijających się, takich jak RPA (Scragg et al. 1978), Meksyk (Munhoz et al. 1979) i Bangladesz (Stool et al. 1982) są odpowiedzialne za najcięższe formy biegunki i w próbie z Porto Velho były często związane z wymiotami (90%) i obecnością krwi w stolcu (80%), wskazując na poważne uszkodzenie błony śluzowej jelita.

Nie wykryto żadnego przypadku zakażenia Campylobacter species w przypadkach biegunki w Porto Velho, podczas gdy ten enteropatogen jest często obserwowany w São Paulo (Gomes et al. 1991). W próbce z Porto Velho zaobserwowano jeden przypadek biegunki związanej z Y. enterocolitica. Chociaż Y. enterocolytica była już opisywana w przypadkach biegunki w Rio de Janeiro, rzadko znajdowano ją w innych rejonach. Warto zauważyć, że jest on często związany z biegunką w Kanadzie, co sugeruje lepsze przystosowanie tego gatunku do zimnego środowiska.

Podsumowując, obecne badanie wykazało, że rozmieszczenie enteropatogenów związanych z biegunką w Porto Velho jest podobne do tego obserwowanego w północno-wschodnich i wschodnich obszarach Amazonii w stanie Pará. Ponadto, niektóre cechy szczególne zaobserwowane w tym badaniu wzbudzają zainteresowanie dalszymi badaniami nad enteropatogenami w zachodniej Amazonii, mającymi na celu lepszą identyfikację grup, podgrup i wariantów patogenów wirusowych i bakteryjnych występujących w tym regionie oraz informacji na temat oporności na antybiotyki.

ACKNOWLEDGMENTS

Do Dr Luiz Rachid Trabulsi, Instituto Butantã, za jego cenne uwagi i za przeczytanie oryginalnego manuskryptu.

• Bern C, Martines J, Zousa I, Glass RI 1992. The magnitude of the global problem of diarrhoeal disease: a ten years update. Bull WHO 70: 705-714.

• Georges MC, Wachsmuth IK, Meunier DMV, Nebout N, Didier F, Siopathis MR, Gorges AJ 1984. Pasożytnicze, bakteryjne i wirusowe patogeny jelitowe związane z biegunką w Republice Środkowoafrykańskiej. J Clin Microbiol 19: 571-575.

• Gomes T, Rassi V, Macdonald K, Ramos S, Trabulsi LR, Vieira M, Guth B, Candeias J, Ivey C, Toledo MR, Blake P 1991. Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in São Paulo, Brazil. J Infect Dis 7: 164-331.

• Guerrant RL, Kirchhoff LV 1983. Prospektywne badanie chorób biegunkowych w północno-wschodniej Brazylii: wzorce choroby, wpływ żywienia, etiologii i czynników ryzyka. J Infect Dis 7: 753-759.

• Leal N, Cavalcanti T, Hofer E 1988. Enteropatogeny wykrywane u zdrowych dzieci w trzech społecznościach o niskich dochodach w Recife, stan Pernambuco, Brazylia. Mem Inst Oswaldo Cruz 83: 153-159.

• Linhares AC 1997. Zakażenie rotawirusem w Brazylii: epidemiologia, odporność i możliwości szczepień. Braz J Infect Dis 1: 284-293.

• Munhoz OH, Coelho-Ramirez P, Serafin FA, Olarte J, Pickering LK, Du Pont H, Gutierrez G 1979. Gastroenteritis infecciosa aguda. Etiologia i jej korelacja z objawami klinicznymi i moczem kałowym. Arch Invest Med 10: 135-145.

• Plano Plurianual de Saúde, Rondônia 1996. Sekretariat Stanu Zdrowia Rondônia, 168 stron.

• Riley LW, Ceballos BJO, Trabulsi LR, Toledo MRF, Blake PA 1984. Znaczenie szpitali jako rezerwuarów dla endemicznych wieloopornych Salmonella typhimurium powodujących zakażenia w miejskich brazylijskich dzieci. J Infect Dis 150: 236-241.

• Scragg JN, Rubidge CJ, Appelbaum PC 1978. Zakażenie Shigella w afrykańskich i indyjskich dzieci ze szczególnym uwzględnieniem posocznicy Shigella. J Pediatr 93: 796-797.

• Stool BJ, Glass RJ, Huq MI, Khan MU, Bann H, Holt J 1982. Epidemiologic and clinical features of pacients infected with Shigella who attended a diarrheal disease hospital in Bangladesh. J Infect Dis 146: 177-183.

• Tornieporth NG, John J, Salgado K, Jesus P, Latham E, Melo MCN, Gunzburg ST, Riley LW 1995. Differentation of pathogenic Escherichia coli strains in Brazilian children by PCR. J Clinical Microbiol 33: 1371-1374.

• Trabulsi LR, Toledo MRF, Ceballos BSO, Candeias JAN 1985a. Epidemiology of diarrhoeal diseases in South America. Elsevier Science Publisher 12: 121-125.

• Trabulsi LR, Toledo, MRF, Murahovschi J, Neto UF, Candeias JAN 1985b. Epidemiology of infantile bacterial diarrheal disease in Brazil. Bact Diar Dis 20: 25-36.

Rysunek | Tabela I | Tabela II | Tabela III

.