Diagnosis of Legionella Infection

Abstract

Legionellae, które są ważną przyczyną zapalenia płuc u ludzi, nadal są błędnie oznaczane jako patogeny egzotyczne. Możliwość rozpoznania zakażenia Legionella jest ograniczona przez niespecyficzny charakter obrazu klinicznego i niedoskonałości testów diagnostycznych. Pomimo ostatnich udoskonaleń, istniejące testy diagnostyczne w kierunku zakażeń Legionella albo nie są wystarczająco czułe, aby wykryć wszystkie klinicznie ważne legionelle, albo nie są w stanie dostarczyć wyników w klinicznie użytecznym czasie. Zrozumienie lokalnej epidemiologii Legionella jest ważne przy podejmowaniu decyzji o tym, czy badać w kierunku zakażenia Legionella i jakie testy diagnostyczne stosować. W większości sytuacji zastosowanie zarówno testu na obecność antygenu w moczu, jak i posiewu plwociny jest najlepszą kombinacją diagnostyczną. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest obiecującym narzędziem, ale standaryzowane testy nie są dostępne w handlu. Dalsze prace muszą skupić się na opracowaniu testów na obecność antygenów w moczu, które wykrywają szerszy zakres patogennych legionelli oraz na opracowaniu standaryzowanych testów PCR.

Choroba legionistów nadal ma reputację egzotycznej infekcji. Wręcz przeciwnie, przy systematycznym poszukiwaniu, gatunki Legionella są konsekwentnie uznawane za jedną z powszechnych przyczyn zapalenia płuc. Jednak poza środowiskiem badawczym potwierdzone rozpoznania legionellozy są rzadkie. Ten brak rozpoznania choroby legionistów w rutynowej praktyce wynika w dużej mierze z 3 czynników: niemożności klinicznego i radiograficznego odróżnienia choroby legionistów od innych przyczyn zapalenia płuc, niezlecania badań diagnostycznych w kierunku zakażenia Legionella oraz niedoskonałości dostępnych testów diagnostycznych. Choroba legionistów jest dokładniej opisywana jako nieuchwytne rozpoznanie, a nie egzotyczne zakażenie.

Mimo że metody diagnostyczne uległy poprawie w ciągu 25 lat od pierwszego opisania Legionella pneumophila, żaden z obecnie dostępnych testów nie jest w stanie rozpoznać choroby legionistów w odpowiednim czasie z dużą czułością i swoistością. Rzeczywiście, niektórzy autorzy kwestionowali rutynowe zlecanie jakichkolwiek badań mikrobiologicznych u pacjentów z zapaleniem płuc, popierając to danymi sugerującymi, że takie badania nie mają istotnego wpływu na wybór antybiotykoterapii i wynik pacjenta. Ostatnio Marrie argumentował, że takie podejście do diagnostyki choroby legionistów jest błędne. Niewykonanie testu w kierunku zakażenia Legionellą może opóźnić rozpoznanie ognisk choroby legionistów, może przeoczyć zmiany w epidemiologii choroby (w tym rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe) i może uniemożliwić osobom ubieganie się o odszkodowanie z tytułu zakażenia nabytego w miejscu pracy. Co ważne, możliwe jest wybranie podgrupy pacjentów, dla których wydajność testów diagnostycznych w kierunku zakażenia Legionellą jest wysoka i którzy odnieśliby korzyści z określonej diagnozy.

W niniejszym przeglądzie skupiono się na aktualnych testach diagnostycznych w kierunku zakażenia Legionellą, ze szczególnym uwzględnieniem testów umożliwiających postawienie diagnozy w czasie, który będzie miał wpływ na początkowe postępowanie w przypadku zakażenia. Dokonując przeglądu różnych testów diagnostycznych w kierunku zakażenia Legionellą, należy pamiętać o kilku czynnikach. Po pierwsze, do rozpoznania zakażenia Legionellą wymagane są testy specjalistyczne, które muszą być specjalnie zlecone przez lekarza klinicystę. Po drugie, ważne jest, aby docenić różnicę pomiędzy wykonaniem testu w laboratorium badawczym a tym, co może być realistycznie osiągnięte w lokalnym laboratorium diagnostycznym. Udokumentowano znaczną zmienność międzylaboratoryjną w odniesieniu do zdolności hodowania legionelli i jest to również prawdopodobne w odniesieniu do innych testów. Po trzecie, interpretacja wyników testów diagnostycznych jest utrudniona przez brak odpowiedniego „złotego standardu”. Obliczone dane dotyczące czułości i specyficzności będą się różnić w zależności od różnych standardów porównawczych. Po czwarte, na przydatność testów diagnostycznych ma wpływ lokalna epidemiologia Legionella. L. pneumophila serogrupa 1 jest dominującą przyczyną legionellozy w wielu, jeśli nie w większości, rejonów świata, a zakażenie tym organizmem jest łatwiejsze do zdiagnozowania niż zakażenie innymi gatunkami i serogrupami Legionella. W niektórych regionach inne gatunki i grupy serologiczne są ważniejsze. Na przykład, Legionella longbeachae jest główną przyczyną legionellozy w Australii i Nowej Zelandii, gdzie jest często związana z narażeniem na działanie mieszanki doniczkowej. Zakażenie tym gatunkiem nie zostanie wykryte przez obecne testy antygenów moczu i zostanie przeoczone przez laboratoria, które wykonują testy serologiczne tylko dla L. pneumophila.

Hodowla

Diagnostyka hodowlana wymaga specjalnych podłoży, odpowiedniego przetwarzania próbek i wiedzy technicznej (tabela 1). Uzyskanie pozytywnego wyniku wymaga kilku dni, przy czym większość kolonii Legionella jest wykrywana w ciągu 3-5 dni. Standardowym podłożem używanym do hodowli Legionellae jest agar z buforowanym wyciągiem z węgla drzewnego (BCYE) uzupełniony α-ketoglutaranem, z lub bez środków przeciwbakteryjnych. Podłoże to dostarcza żelaza i L-cysteiny, które są niezbędne do wzrostu legionelli. Wzrost niektórych gatunków Legionella (np. Legionella micdadei i Legionella bozemanii) jest wzmocniony przez dodanie do agaru BCYE albuminy surowicy bydlęcej, a dodanie barwników wskaźnikowych do pożywki może ułatwić identyfikację. Podłoża hodowlane zawierające cefamandol będą hamować wzrost gatunków Legionella, które nie wytwarzają β-laktamazy, takich jak L. micdadei i L. bozemanii .

Legionellae mogą być izolowane z różnych typów próbek, chociaż wydzieliny dolnych dróg oddechowych (np, plwocina i próbki z bronchoskopii) są próbkami z wyboru. Głównym ograniczeniem hodowli plwociny jest fakt, że mniej niż połowa pacjentów z chorobą legionistów produkuje plwocinę. Inne czynniki wpływają na czułość posiewu po uzyskaniu próbki plwociny. Bakterie Legionella mogą słabo przeżywać w wydzielinie z dróg oddechowych, dlatego próbki te powinny być niezwłocznie przetwarzane. Niektórzy pacjenci z chorobą legionistów wytwarzają plwocinę, która ma stosunkowo niewielki stopień oczyszczania; próbki te mogą być odrzucane przez laboratoria, które odrzucają próbki plwociny zawierające niewiele leukocytów wielojądrzastych. W związku z tym, kryteria odrzucenia nie powinny być stosowane do próbek plwociny wysyłanych na posiew na Legionella. Doświadczenie personelu laboratoryjnego jest również ważne, a laboratoria doświadczone w hodowli Legionella mają większe szanse na odzyskanie organizmu.

Oszacowana czułość hodowli plwociny wynosi od <10% do ∼80% i różni się w zależności od różnych standardów porównawczych i poszczególnych laboratoriów. W praktyce, lepsze wyniki mogą być osiągnięte tylko przez laboratoria, które są szczególnie zainteresowane zakażeniami Legionella, a czułość jest zwykle <50%, gdy wyniki serologiczne są używane jako standard. Próbki bronchoskopowe prawdopodobnie dadzą większą wydajność diagnostyczną niż próbki odkrztuszanej plwociny.

Gatunki Legionella mogą być izolowane z posiewów krwi, ale wydajność jest niska. Wzrost legionelli jest utrzymywany przez rutynowe podłoża do hodowli krwi, ale może nie uruchamiać alarmu w komercyjnych urządzeniach do hodowli krwi. W związku z tym konieczne są ślepe subkultury na podłoża stałe. Ogólnie, wydajność posiewów krwi jest niska i prawdopodobnie nie wpłynie na postępowanie kliniczne.

Bezpośrednie barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi (Dfa)

Barwienie Dfa może wykryć legionellae w wydzielinach z dróg oddechowych i próbkach tkanek. Technika ta ma tę zaletę, że daje wynik w ciągu 2-4 godzin, ale jest wymagająca technicznie i powinna być wykonywana przez doświadczony personel laboratoryjny. Zgłaszane czułości barwienia DFA różnią się, są konsekwentnie mniejsze niż czułości hodowli i są mniej dokładnie znane dla gatunków innych niż L. pneumophila. Dla wydzielin dolnych dróg oddechowych, czułość zazwyczaj wynosi 25%-66%, przy czym próbki płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego mają wyższą wydajność niż próbki przeztchawicze lub plwocina. Swoistość barwienia DFA została oszacowana na ∼94%, chociaż test może być mniej swoisty w przypadku niedoświadczonych rąk. Wyniki fałszywie dodatnie mogą wystąpić z powodu reakcji krzyżowych z innymi bakteriami, w tym Bacteroides fragilis, Pseudomonas species, Stenotrophomonas species i Flavobacterium species. Reakcje krzyżowe mogą być mniejszym problemem, gdy stosowane są środki DFA z przeciwciałami monoklonalnymi. Problemy z czułością i swoistością ograniczyły zastosowanie barwienia DFA, a dodatni wynik DFA przy braku innych dowodów potwierdzających nie jest obecnie ogólnie akceptowany jako wystarczający do rozpoznania zakażenia Legionellą.

Detekcja antygenu moczu

Detekcja rozpuszczalnego antygenu Legionelli w próbkach moczu jest szybką metodą, która zapewnia wczesną diagnozę zakażenia Legionellą i jest użytecznym narzędziem do badania ognisk choroby legionistów. Komercyjne zestawy, które wykorzystują zarówno metodologię RIA jak i EIA są dostępne od kilku lat i mają podobną charakterystykę działania. Ostatnio opracowano test immunochromatograficzny (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax), który charakteryzuje się podobną czułością i swoistością jak EIA . Test ten jest łatwy do wykonania i może dostarczyć wynik w ciągu 15 minut.

Do wykrywania L. pneumophila serogrupa 1, testy antygenów moczowych mają czułość w zakresie 70%-100% i swoistość zbliżoną do 100% . Czułość może być zwiększona aż o 20% poprzez 25-krotne zagęszczenie próbek moczu przed badaniem. Główną wadą tych testów jest ich niezdolność do wiarygodnego wykrywania organizmów innych niż L. pneumophila serogrupa 1. Opracowano testy o szerokim spektrum działania, które wykrywają rozpuszczalne antygeny wielu różnych gatunków Legionella, ale nie są one dostępne w handlu. Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) jest przeznaczony do wykrywania Legionellae innych niż L. pneumophila serogrupa 1, ale robi to mniej wiarygodnie niż wykrywa L. pneumophila serogrupa 1. Fałszywie dodatnie wyniki antygenu moczu wystąpiły u pacjentów z chorobą surowiczą .

Antygenuria legionella może być wykryta już 1 dzień po wystąpieniu objawów i utrzymuje się przez dni do tygodni. W jednym przypadku udokumentowano, że wydalanie antygenu występuje przez >300 dni. Rozpuszczalne antygeny Legionella zostały również wykryte w próbkach innych niż mocz, w tym w próbkach plwociny, tkanki płucnej, surowicy i płynu opłucnowego, chociaż wykorzystanie takich próbek nie zostało w pełni ocenione.

Testowanie antygenów moczowych jest obecnie uznanym i cennym narzędziem w diagnostyce choroby legionistów, szczególnie w regionach, w których L. pneumophila serogrupa 1 jest najczęstszą przyczyną choroby. W miejscach, gdzie tylko mniejszość zakażeń jest powodowana przez L. pneumophila serogrupa 1, obecnie dostępne testy antygenów moczowych wnoszą mniejszy wkład do istniejących badań laboratoryjnych.

Badania serologiczne

Badania serologiczne w kierunku zakażenia Legionella są cennym narzędziem epidemiologicznym, ale mają niewielki wpływ na podejmowanie decyzji klinicznych ze względu na opóźnienie czasowe zanim wynik będzie dostępny. Przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na zakażenie są zazwyczaj mieszaniną IgA, IgM i IgG, a testy powinny wykrywać wszystkie typy w celu uzyskania optymalnej czułości. Pomiar specyficznej IgM jest niewiarygodnym markerem ostrego zakażenia, ponieważ przeciwciała IgM mogą utrzymywać się przez długi okres czasu. Serokonwersja może trwać kilka tygodni, co jest głównym ograniczeniem testów serologicznych. W większości przypadków, 4-krotny wzrost miana przeciwciał jest wykrywany w ciągu 3-4 tygodni, ale w niektórych przypadkach może to trwać >10 tygodni. Zbyt wczesne uzyskanie próbek surowicy w fazie rekonwalescencji niewątpliwie prowadzi do wielu wyników fałszywie ujemnych i prawdopodobnie częściowo tłumaczy 20%-30% pacjentów z chorobą legionistów, u których rzekomo nie występuje wykrywalna odpowiedź przeciwciał. Jest jednak jasne, że u części osób z potwierdzonym zakażeniem Legionellą nie dochodzi do wykrywalnej serokonwersji. W praktyce, klinicyści powinni być zachęcani do pobierania próbek surowicy w fazie rekonwalescencji 3 tygodnie po wystąpieniu choroby w celu przeprowadzenia testów równolegle z surowicą uzyskaną w fazie ostrej. Jeśli po tym okresie nie nastąpi serokonwersja i nadal podejrzewa się zakażenie Legionella, należy uzyskać dodatkową próbkę w fazie rekonwalescencji.

Spośród różnych dostępnych metod wykrywania przeciwciał, standardowym testem referencyjnym jest immunofluorescencja pośrednia. 4-krotny lub większy wzrost miana przeciwciał do ⩾128 jest uważany za diagnostyczny. Miano przeciwciał ⩾256 w ostrej fazie w obecności zapalenia płuc było kiedyś uważane za wystarczające do postawienia wstępnej diagnozy, ale okazało się to niewiarygodne, szczególnie biorąc pod uwagę wysoką częstość występowania dodatnich miana przeciwciał Legionella u niektórych osób bez klinicznych dowodów legionellozy. Nie ma praktycznie żadnej roli w badaniu pojedynczych próbek surowicy.

Inną wadą badań serologicznych jest niezdolność do dokładnego wykrywania wszystkich gatunków i grup serologicznych Legionella. Chociaż serokonwersja do L. pneumophila serogrupy 1 jest ogólnie uważana za wysoce predykcyjną dla choroby, czułość i swoistość serokonwersji do innych gatunków i serogrup nie została rygorystycznie potwierdzona. Ponadto, tworzenie przeciwciał reagujących krzyżowo wśród członków rodziny Legionellaceae może utrudniać określenie gatunku zakażającego lub grupy serologicznej. Niektórzy pacjenci z infekcją inną niż L. pneumophila serogrupa 1 będą mieli serokonwersję do L. pneumophila serogrupa 1 . I odwrotnie, oparta na sekwencji identyfikacja produktów PCR Legionella od pacjentów, u których wystąpiła serokonwersja do gatunków Legionella innych niż L. pneumophila wskazuje, że niektórzy z nich byli prawdopodobnie zakażeni L. pneumophila (obserwacje niepublikowane). Przeciwciała reagujące krzyżowo występują również sporadycznie u pacjentów z infekcjami wywołanymi przez bakterie inne niż Legionella, w tym pseudomonady, prątki, gatunki Bacteroides i Campylobacter. Interesująca reakcja krzyżowa występuje między L. bozemanii i Rickettsia typhi w wyniku wspólnego antygenu.

Amplifikacja kwasu nukleinowego

Ostatnio techniki wykrywania DNA okazały się obiecujące w szybkiej diagnostyce zakażeń Legionella. PCR umożliwia specyficzną amplifikację niewielkich ilości DNA Legionelli, dostarcza wyniki w krótkim czasie i ma potencjał do wykrywania zakażeń wywołanych przez każdy gatunek i serogrupę Legionelli. Obecnie metoda Legionella PCR jest dostępna tylko w ograniczonej liczbie laboratoriów, które stosują różne metody własne.

PCR jest z powodzeniem stosowana do wykrywania DNA Legionella w wielu próbkach środowiskowych i klinicznych. W przypadku badania próbek z dolnych dróg oddechowych, PCR wielokrotnie wykazywał czułość równą lub większą niż hodowla. Rzeczywiście, PCR może być uważany za test z wyboru dla pacjentów, którzy produkują plwocinę. Rola PCR w badaniu innych rodzajów próbek jest mniej jasna. DNA Legionella może być wykryte w próbkach moczu, surowicy i leukocytów pobranych od pacjentów z chorobą legionistów z czułością 30%-86%. Czułość PCR prawdopodobnie wzrasta w przypadku badania próbek uzyskanych we wczesnym okresie choroby oraz w przypadku badania >1 rodzaju próbki od każdego pacjenta. Wymazy z gardła mogą być również odpowiednią próbką do testowania PCR, ale to zastosowanie zostało ocenione tylko w jednym badaniu .

Potrzebna jest dalsza praca w celu ustalenia standardowej metody PCR, która będzie wystarczająco solidna, aby mogła być stosowana poza środowiskiem laboratorium badawczego. Jej zastosowanie do próbek nieoddechowych jest szczególnie atrakcyjne, ponieważ pozwoli to ominąć problem pacjentów, którzy nie produkują próbek plwociny. Opracowanie optymalnego testu PCR było skomplikowane z powodu sporadycznego zanieczyszczenia niektórych komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA DNA Legionella. Użycie tych zestawów do przetwarzania próbek może skutkować wynikami fałszywie dodatnimi i podkreśla znaczenie włączenia odpowiednich kontroli do każdego badania.

Strategia badania

Ponieważ choroba legionistów nie może być klinicznie lub radiograficznie odróżniona od innych przyczyn zapalenia płuc, decyzja o badaniu w kierunku zakażenia Legionella może być trudna i często jest podejmowana błędnie. Ważne jest, aby zapoznać się z lokalną epidemiologią. Niektóre laboratoria na obszarach, gdzie gatunki Legionella są częstą przyczyną zapalenia płuc, zdecydowały się na rutynowe hodowanie wszystkich próbek plwociny pobranych od pacjentów z zapaleniem płuc na podłożach Legionella. Niewiele laboratoriów jest jednak w stanie uzasadnić dodatkowe koszty związane z rutynową hodowlą Legionella. W większości miejsc częstość występowania zakażeń Legionella jest nieznana, a decyzja o zleceniu badań diagnostycznych w kierunku zakażenia Legionella jest zwykle ograniczona do pacjentów z grupy ryzyka, pacjentów z ciężkim zapaleniem płuc oraz do scenariuszy epidemicznych. Z pewnością możliwe jest wyodrębnienie podgrupy pacjentów, u których wydajność testów diagnostycznych w kierunku Legionella będzie stosunkowo wysoka. Do tej grupy należą osoby starsze, palacze, osoby z obniżoną odpornością, osoby z przewlekłymi chorobami płuc, pacjenci przebywający w szpitalach, w których woda jest skolonizowana przez bakterie Legionella oraz osoby narażone na kontakt z mieszanką doniczkową. Częstość występowania choroby legionistów jest wyższa wśród pacjentów z ciężkim zapaleniem płuc i wszyscy pacjenci z zapaleniem płuc, którzy są przyjmowani na oddział intensywnej terapii powinni być badani w kierunku tego zakażenia.

W miejscach, gdzie L. pneumophila serogrupa 1 jest dominującą przyczyną zakażeń Legionella lub podczas wybuchu epidemii zakażeń L. pneumophila serogrupa 1, badanie antygenu w moczu jest szczególnie cennym narzędziem diagnostycznym. Opracowanie komercyjnego testu na obecność antygenu w moczu, który w sposób wiarygodny wykrywałby również inne patogeny Legionella u ludzi, byłoby dużym postępem i prawdopodobnie sprawiłoby, że byłby to test diagnostyczny z wyboru w prawie wszystkich warunkach. W miejscach geograficznych, gdzie legionelle inne niż L. pneumophila serogrupa 1 są ważnymi patogenami, obecne testy antygenów moczu są nadal przydatne, ale nie powinny być stosowane jako jedyne narzędzie diagnostyczne. Jeśli jest dostępny, Legionella PCR w połączeniu z badaniem antygenów moczu jest prawdopodobnie najlepszą strategią badania wstępnego, która wykryje wszystkie gatunki Legionella i dostarczy wyniki w czasie, który będzie miał wpływ na postępowanie kliniczne.

Gdy PCR jest niedostępny, badanie antygenów moczu w połączeniu z hodowlą próbek z dolnych dróg oddechowych jest najlepszą kombinacją badań. Kultura pozostaje ważnym narzędziem diagnostycznym, ale jej stosunkowo niska czułość i zależność od dostępności próbki z dolnych dróg oddechowych sprawiają, że nie jest ona odpowiednia jako jedyny test diagnostyczny. Chociaż badania serologiczne nie mają wpływu na początkowe postępowanie, mogą być przydatne, jeżeli nie zostanie postawiona właściwa diagnoza podczas ostrej fazy zakażenia, ale zarówno próbki z fazy ostrej jak i rekonwalescencji muszą być badane równolegle. Podczas podejrzenia wybuchu epidemii choroby legionistów uzasadnione jest agresywne podejście do diagnostyki, które obejmowałoby zastosowanie kombinacji metod badawczych.

Legionella species mogą czasami powodować gorączkę Pontiac, ostrą, gorączkową, niepłucną chorobę charakteryzującą się dużą częstością ataków, krótkim okresem inkubacji i szybkim powrotem do zdrowia. Rozpoznanie gorączki Pontiac zazwyczaj opiera się na rozpoznaniu typowych cech klinicznych podczas epidemii, a diagnoza jest potwierdzana poprzez badania serologiczne u osób dotkniętych chorobą. Wykorzystanie hodowli jest w dużej mierze ograniczone do badania próbek środowiskowych w celu określenia źródła epidemii, chociaż L. pneumophila serogrupa 1 została wyizolowana z aspiratu tchawicy dziecka z gorączką Pontiac.

Wnioski

Zakażenie legionellą jest niewątpliwie słabo rozpoznane. Diagnostyka opiera się na zastosowaniu specjalistycznych testów, często w połączeniu. Testy na obecność antygenów w moczu, posiew plwociny i badanie PCR próbek z dolnych dróg oddechowych są najważniejszymi narzędziami diagnostycznymi w wykrywaniu zakażenia Legionellą we wczesnym okresie choroby. Rozwój testów na obecność antygenów w moczu, które wykrywają szerszy zakres patogennych legionelli oraz rozwój standaryzowanych testów PCR będą stanowiły duży postęp w diagnostyce Legionelli. Zwiększona dostępność i wykorzystanie ulepszonych testów diagnostycznych pomoże lepiej scharakteryzować epidemiologię choroby legionistów, w tym prawdziwą częstość występowania i zmienność geograficzną.

Podziękowania

Jestem wdzięczny Steve’owi Chambersowi za pomocne komentarze do artykułu w manuskrypcie.

.