Materialen en methoden
We verkregen goedkeuring van de institutionele beoordelingsraad voor bescherming van menselijke proefpersonen van het Air Force Research Laboratory, protocolnummer FWR20180101H. Proefpersonen werden individueel geïnformeerd en ondertekenden toestemmingsdocumenten die door een derde partij werden getuigd. Monsters werden verzameld van vijf proefpersonen met behulp van de Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) en de Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Alle verzamelde monsters werden op dezelfde dag verzameld met ten minste 30 minuten tussen elke verzameling of in de loop van 3 dagen, als gevolg van tijdsbeperkingen voor de deelnemers. Per proefpersoon werden twee swabs verzameld; elk swab werd gedurende 10-15 s tegen de binnenkant van elke wang gewreven. Er werden zes spuugmonsters verzameld: volgens de instructies van de fabrikant, onmiddellijk na het drinken van water, het eten van de lunch, het drinken van een koolzuurhoudende frisdrank, het drinken van een sportdrank of het drinken van koffie.
De swabs werden geëxtraheerd met de Epicentre QuickExtract™ DNA-extractieoplossing 1.0 (Epicentre). Het eerste wattenstaafje werd verwerkt zoals het was en het tweede werd gezuiverd met het Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) volgens het microcentrifugeerprotocol voor de zuivering van genomisch DNA uit cellysaten van weefselkweekcellen. Er was geen celwasstap omdat de monsters reeds in oplossing waren. De spuug monsters werden geëxtraheerd met behulp van de QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) met de fabrikant gemodificeerd speeksel extractie protocol.
Monsters werden gekwantificeerd met behulp van de NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en de Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) met de Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. De NanoDrop werd ook gebruikt om de zuiverheid van de monsters te beoordelen door vergelijking van de absorptiewaarden bij 260 en 280 nm (A260/A280). Beide werden gebruikt volgens de protocollen van de fabrikant. De geëxtraheerde monsters, genormaliseerd tot 10 ng/μL op basis van Qubit-concentraties, werden geanalyseerd met een 2% E-Gel® Precast Agarose Gel (Thermo Fisher Scientific). De Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) werd samen met de High Sensitivity DNA Chip gebruikt om de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA te bepalen.
De monsters werden vervolgens geanalyseerd op het Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) om te testen op twee genetische markers die verband houden met pinda-allergieën: rs7192 en rs9275596 . Genotypering met snelle aanloop pre-polymerasekettingreactie (PCR) instelling van 60 °C gedurende 1 min, een hold-cyclus van 95 °C gedurende 10 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s dan 60 °C gedurende 1 min, en een post-PCR bij 60 °C gedurende 1 min. TaqPath ProAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt. De single nucleotide polymorphism (SNP) assays werden gebruikt in de helft van de door de fabrikant aanbevolen concentratie. Het uiteindelijke volume was 10 µL.
Resultaten
De swab-extractiemethode met de QuickExtract-oplossing resulteerde in een grote hoeveelheid DNA. De waarden van DNA verkregen uit de swab zonder verdere bewerking varieerden van 1,38 tot 54,2 pg/µL, zoals bepaald door de Bioanalyzer (Additional file 1: Tabel S1). Eerdere niet-gerapporteerde resultaten van ons lab toonden echter aan dat sequencing-experimenten werden geremd wanneer bibliotheken rechtstreeks uit de QuickExtract-oplossing extracties werden bereid. Daarom hebben we gezuiverd deze monsters met behulp van een Wizard kolom zuiveringsprotocol, waardoor de concentratie, zoals verwacht (variërend van 2,59 tot 38,2 pg / microl), en het verbeteren van de A260 / 280 ratio’s tot dichter bij de algemeen aanvaarde bereik (1,8-2,1).
Spit monsters verzameld volgens protocol van de fabrikant en geëxtraheerd met behulp van de QIAamp Bloed DNA Kit had een bereik van 1,01 ng / ul tot 8,20 ng / ul. De zuiverheid aangegeven door de A260/A280 meting was meestal in het bereik voor DNA (zie Additional file 1: tabel S1). Geen van de spuugmonsters die werden verzameld nadat de proefpersonen verschillende drankjes hadden gedronken of hadden geluncht, vertoonde DNA-concentraties en -zuiverheidswaarden die significant verschilden van die welke werden verzameld volgens het protocol van de fabrikant (30 minuten vasten) (Fig. 1).
Bemonsteringsconcentraties met behulp van drie verschillende kwantificatiemethoden (Nanodrop, Qubit en Bioanalyzer) en een zuiverheidsbeoordeling aan de hand van de verhouding tussen de absorptie bij 260 en 280 nm. De “CatchAll”-omstandigheden zijn de twee swabverzamelingen en de “Genefix”-omstandigheden zijn de zes spuugverzamelingen. De swabmonsterconcentraties worden op de linker y-as uitgezet, de spuugmonsterconcentraties op de rechter y-as. Er werden twee assen gebruikt aangezien het swabmonster zonder secundaire zuivering (CatchAll + QuickExtract) contaminanten bevat die bij 260 nm in de Nanodrop absorberen. *p < 0,05, ***p < 0,001
Geëxtraheerde monsters genormaliseerd tot 10 ng/μL zoals bepaald door Qubit 4.0 metingen werden uitgevoerd op een 2% E-Gel met behulp van een 1-kb ladder (Additional file 1: figuur S1). We verwachtten een band te zien aan de bovenkant van de gel die een hoog moleculair gewicht DNA-extractie vertegenwoordigt. Zoals verwacht was het geëxtraheerde DNA van de verschillende speekselafnamemethoden van hoog moleculair gewicht. Ondanks normalisatie tot een 10-ng/µL input, resulteerden de meeste swabmonsters niet in een duidelijke band, wat ofwel de aanwezigheid van ladingsinterferenties of een andere systematische kwestie suggereert.
Meer gedetailleerde grootte- en zuiverheidsanalyse op een Bioanalyzer toonde aan dat alle monsters en alle condities overwegend DNA met een hoog moleculair gewicht en vergelijkbare concentraties hadden (Fig. 2). Afgezien van de eerder genoemde lage concentratie na zuivering van de swab-extractie zijn er geen aan de afnameconditie (eten of drinken) gerelateerde trends in DNA-kwaliteit, -grootte of -concentratie die duidelijk worden bij het analyseren van de elektroferogramsignalen. Er lijkt wel een onderwerpsafhankelijke verandering te zijn, hoewel dit fenomeen niet verder is onderzocht.
Bioanalyzer-elektroferogramsporen van de spuugmonsters. Elke proefpersoon wordt afzonderlijk getoond met kleuren die de afnameomstandigheden weergeven: volgens de instructies van de fabrikant (rood), na consumptie van water (blauw), na het nuttigen van een lunch (groen), na consumptie van een koolzuurhoudende drank (cyaan), na consumptie van een sportdrank (magenta), en na consumptie van koffie (oranje)
Ten slotte gebruikten we SNP-genotypering om de geschiktheid van het geëxtraheerde DNA voor downstream moleculaire processen te testen (Fig. 3). Alle geëxtraheerde monsters van alle proefpersonen waren met succes in staat om bruikbare resultaten te produceren voor genotypering van twee SNP’s die geassocieerd zijn met pinda-allergie, met uitzondering van één van de gezuiverde swabmonsters (proefpersoon 5B).
Allelische discriminatieplots voor rs7192 en rs9275596. De “X” geeft een monster aan dat niet geamplificeerd is (Onderwerp 5B). Rood/onderste monsters zijn homozygoot voor allel 1 (X-as), groen/centraal monsters zijn heterozygoot, en blauw/links monsters zijn homozygoot voor allel 2 (Y-as)
Discussie
Bij het ontwerpen van een genetische onderzoeksstudie, een commercieel product of een interventie in de gezondheidszorg zijn gebruiksvriendelijkheid en naleving door de eindgebruiker twee cruciale overwegingen. Hulpmiddelen voor bloedafname waarbij huidprikken nodig zijn, kunnen een lagere therapietrouw hebben als gevolg van afkeer van pijn. Uit waarnemingen in ons lab is ons anekdotisch opgevallen dat het aantal deelnemers aan studies daalt wanneer het belangrijkste verschil venapunctie versus speekselafname is. We hebben geen gecontroleerde studie uitgevoerd om dit fenomeen te onderzoeken; in plaats daarvan hebben we gekozen voor speekselafname op basis van het gebruiksgemak, de klaarblijkelijke toename van het aantal inschrijvingen en het soort onderzoek dat hoofdzakelijk in ons lab wordt uitgevoerd. Aangezien in onze studies het speeksel zelf wordt afgenomen, wilden wij nagaan of er voldoende DNA van voldoende kwaliteit aanwezig is voor gebruik in downstream moleculaire toepassingen na verschillende waarschijnlijke veldafnameomstandigheden, voornamelijk verschillende voedsel- en drankinnames. De studieopzet was niet bedoeld voor kruisvergelijking tussen individuen; we probeerden eerder de intra-subject variabiliteit van de staalafname te vergelijken. Met dit doel voor ogen hebben we geen significante afname in DNA-hoeveelheden waargenomen die werd veroorzaakt door variatie van de instructies van de fabrikant om 30 min. te vasten vóór de afname.
Hoewel de hoeveelheid DNA belangrijk is, is de kwaliteit van het verkregen DNA van groter belang voor geavanceerde moleculair-biologische technieken. In onze studie vonden we dat het verzamelen van speekselmonsters na eten en drinken geen invloed had op de opbrengst van DNA met een hoog moleculair gewicht. Dergelijk DNA is van cruciaal belang voor de volgende generatie sequencing, array scanning en PCR genotypering. Bovendien toonde een experimentele test met twee onafhankelijke genetische doelen in PCR-genotypering aan dat deze monsters geschikt waren voor moleculaire analyses.
Het doel van deze studie was om te zien of de kwaliteit en kwantiteit van het DNA van de speekselafname door een speeksel-DNA-afnamekit zou worden beïnvloed door het niet volgen van de aanwijzingen van de fabrikant, d.w.z. drinken of eten vlak voor de afname. In overeenstemming met onze hypothese zagen we geen verschil in kwantiteit of kwaliteit van het geïsoleerde DNA.
Conclusie
Genetische studies hebben zich uitgebreid tot buiten het domein van een zuiver wetenschappelijke inspanning en zijn nu gebruikelijk bij het consumentenpubliek. Om menselijke monsters voor deze studies te optimaliseren, streven fabrikanten ernaar eenvoudige, robuuste verzamelmethoden te ontwikkelen. Afname van speeksel is de minst invasieve van deze methoden, levert DNA van hoge kwaliteit op en biedt een uitstekende productstabiliteit. Onze studie van het DNA verkregen uit speeksel na consumptie van verschillende dranken en/of snacks heeft aangetoond dat er geen significant verschil is in de kwantiteit en kwaliteit van het DNA verzameld met behulp van de Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kit (Isohelix) wanneer de monsters niet volgens het protocol van de fabrikant worden verzameld. Hoewel de steekproefomvang in deze studie klein is, zijn waarnemingen uit andere studies in ons laboratorium consistent met de resultaten van onze systematische vergelijking die hier wordt gepresenteerd. We concluderen daarom dat speekselafname een robuuste, niet-invasieve manier is om monsters te verzamelen, zowel in het laboratorium als in het veld, en dat de eis van 30 minuten onthouding van voedsel en drank een ideaal is en geen absolute eis.