Zuurstof (O2) wordt geëvolueerd tijdens fotosynthetisch elektronentransport wanneer water wordt gesplitst door het zuurstof-evoluerende complex om protonen en elektronen te leveren aan de chloroplastische elektronenketen, waardoor ATP en NADPH worden gegenereerd – de energiebron en reducerende kracht voor het metabolisme van planten. Het grootste deel van deze chemische energie wordt gebruikt om het fotosynthetische koolstofmetabolisme aan te drijven, dat bestaat uit ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylering (fotosynthetische koolstofreductiecyclus) en oxygenatie (fotosynthetische koolstofoxidatiecyclus); met een gecombineerde elektronenbehoefte = JA. Voor elke geëvolueerde O2 zijn vier elektronen nodig, zodat de bruto O2-productie (GOP) gerelateerd is aan lineair elektronentransport (J) volgens J/4. Wanneer lineair elektronentransport alleen wordt gebruikt om CO2-fixatie aan te drijven, is het verbruik van O2 en het vrijkomen van CO2 door fotosynthetische koolstofoxidatie en mitochondriale respiratie zodanig dat de netto O2-productie (NOP) gelijk is aan de netto CO2-assimilatie (Anet; mits het respiratoire quotiënt 1 is, maar zie Tcherkez et al, 2017).
Daarnaast kunnen elektronen worden gebruikt voor alternatief niet-cyclisch elektronentransport (ANCET), waaronder bijvoorbeeld de fotoreductie van O2 zelf waarbij reactieve zuurstofsoorten worden gevormd (Mehler-peroxidase-reacties of “water-watercyclus”; Asada, 1999), chloroplastisch anabolisme (bijv. lipiden; Stumpf et al., 1963), de reductie van oxaloacetaat tot malaat (dat naar de mitochondriën wordt geëxporteerd; Scheibe, 2004), en de stikstofassimilatie (Bloom et al., 1989). ANCET is verondersteld als een manier om de ATP/NADPH verhouding te reguleren om aan de veranderende energiebehoeften van het celmetabolisme te voldoen en als een mechanisme om fotoschade te voorkomen door gebruik te maken van overtollig reductant wanneer de fotonfluxdichtheid groter is dan de energiebehoefte van CO2 fixatie (bijv. onder hoge bestraling, koude temperaturen, waterstress die huidmondjes sluit; bijv. Badger, 1985; Ort en Baker, 2002; Robinson, 1988). Belangrijk is dat er geen formeel bewijs is voor hoe elektronenstromen op elkaar inwerken, met name onder fluctuerende lichtomstandigheden (Morales et al., 2018).
Als ANCET het mogelijk maakt om grotere snelheden van lineair elektronentransport in stand te houden, zal het totale elektronentransport (Jt) groter zijn dan JA. Omgekeerd zal het effect op de O2-opname afhankelijk zijn van de betrokken metabolische route. Bijvoorbeeld, in de Mehler-peroxidase reacties, is er geen netto verandering in O2, zodat NOP gelijk zal blijven aan Anet. Maar bij de reductie van nitraat is de verhouding tussen N-gekoppelde O2-productie en O2-verbruik sterk afhankelijk van het gesynthetiseerde aminozuur (Noctor en Foyer, 1998). In dit geval zal NOP niet altijd gelijk zijn aan Anet omdat O2 en CO2 mogelijk niet in evenwicht zijn in het metabolisme (Skillman, 2008). Bijgevolg zijn gelijktijdige metingen van CO2- en O2-fluxen belangrijk om te begrijpen hoe planten het gebruik van lichtenergie regelen, waarbij verschillende loten zeer verschillende metabolische uitkomsten hebben.
De vroegste metingen van O2-evolutie waren niet in staat om GOP te onderscheiden van de opname van O2 (Hill, 1937). De massaspectrometriemethode die door Mehler en Brown (1952) werd ontwikkeld, loste dit probleem op door O2-isotooptracers te gebruiken om de fluxen van 16O2 en 18O2 onafhankelijk te controleren. Bij deze methode werd zuiver 18O2 toegevoerd aan de gasheadspace van een gesloten kamer en werd de afname van 18O2 toegeschreven aan O2-opname. O2 geëvolueerd draagt dezelfde isotopische samenstelling als het water waaruit het wordt gegenereerd, in dit geval, de dominante isotoop in het water was 16 O (Fig. 1). De 18O-labeling benadering werd verder toegepast op bladschijven (b.v. Tourneux en Peltier, 1995), hele uitgesneden bladeren (b.v. Volk en Jackson, 1972), en hele planten (Gerbaud en André, 1980), het verlichten van de bestemming van O2 in vivo.
Eenvoudige weergave van de reacties die betrokken kunnen zijn bij de bruto O2-productie en -opname van een fotosynthetiserende cel, waarbij wordt getoond hoe gelabeld 18O water resulteert in de productie van 18O2 in de aanpak ontwikkeld door Gauthier et al. (2018). In het geval van reacties binnen het peroxisoom en de mitochondriën geeft dit alleen de netto O2 consumptie weer, d.w.z. dat er zowel opname als afgifte plaatsvindt. PSII, Fotosysteem II; PSI, Fotosysteem I; Fd, Ferredoxine; M, Mehler-reactie; PCR; fotosynthetische koolstofreductie; PCO, fotosynthetische koolstofoxidatie; PGA, 3-fosfoglyceraat; P-Glyc, fosfoglycolaat; Glyox, glyoxylaat; OAA, oxaloacetaat; Mal, malaat.
De beperking van gesloten gasuitwisselingssystemen is dat slechts gedurende korte perioden (seconden tot minuten) metingen kunnen worden verricht voordat de CO2-concentratie is uitgeput. Bijgevolg is CO2:O2 niet constant, waardoor de relatieve carboxylatie- en oxygenatiesnelheden veranderen, zodat de ramingen van GOP en O2-opname onnauwkeurig zullen zijn. Deze beperking werd overwonnen in de massaspectrometrische benadering door het verbruikte CO2 te vervangen door periodieke instroom van CO2 in de kamer, waardoor een steady-state kwantificering mogelijk werd en de mogelijkheid om O2 fluxen te meten onder een reeks van omstandigheden en fysiologische toestanden werd uitgebreid (Canvin et al., 1980). Tegelijkertijd werd vooruitgang geboekt in het gebruik van chlorofylfluorescentie, die informatie verschaft over PSII kwantumopbrengst (Baker, 2008). Genty et al. (1989) legden het empirische verband tussen fluorescentie en elektronentransportsnelheid, waardoor de noodzaak om O2-evolutie rechtstreeks te meten, kwam te vervallen. Chlorofylfluorescentie is nu een van de meest populaire technieken in de plantenfysiologie vanwege het gebruiksgemak en de relatief lage kostprijs. Dit wordt in de hand gewerkt door de mogelijkheid om fluorescentiemetingen te multiplexen met H2O en CO2 gasuitwisseling in draagbare, in de handel verkrijgbare instrumenten, waardoor de mogelijkheid ontstaat om de functie van planten buiten het laboratorium te meten. Bijgevolg zijn in vivo metingen van O2-fluxen de afgelopen 20 jaar aanzienlijk afgenomen.
In dit nummer van Plant Physiology herinneren Gauthier et al. (2018) ons eraan waarom het zo belangrijk is om onze aandacht terug te brengen naar O2, door ons te voorzien van een nieuw, elegant open-pad systeem om O2-fluxen te meten. Hun methode is een “omgekeerde” isotopische benadering, waarbij 18O-labeling van bladwater wordt gebruikt in plaats van de lucht, zodat de isotopische samenstelling van O2 die wordt geëvolueerd tijdens watersplitsing een signatuur heeft die heel anders is dan die van omgevings-O2 (Fig. 1). Het gebruik van aanzienlijke 18 O-verrijking is noodzakelijk omdat de bijdrage van NOP in een achtergrond van 21% O2 is waarschijnlijk in de orde van grootte van 0,05% (bijvoorbeeld 100 umol mol-1 NOP/210.000 umol mol-1 omgevings-O2), waardoor het moeilijk normaal om nauwkeurig te detecteren een verandering in δ18 O van O2 geassocieerd met NOP in de lucht rond het blad.
De methode blijft zeer technisch, waarvoor het gebruik van drie hoge precisie-instrumenten. De isotopensamenstelling en de concentratie van CO2 en H2O-damp worden gemeten door laserspectroscopie, en de δ18O2 en δO2/N2 (om de O2-concentratie te schatten) door massaspectrometrie. Een op maat gemaakte kamer is ook nodig om de uitgesneden blad en de 18 O-gelabelde waterbron huis, die helpt om lekken te voorkomen over de pakkingen van rond de bladsteel. Belangrijk is dat de open gasuitwisseling systeem verbetert de mogelijkheid om steady-state metingen te bereiken, en labeling water versus het gebruik van zuiver 18 O 2 gas lost de betaalbaarheid probleem, dat sterk heeft beperkt de goedkeuring van open systems.
While chlorofyl fluorescentie is uitgegroeid tot de populaire optie voor het meten van elektronentransport rate, het is niet zonder aannames. Zo wordt vaak aangenomen dat bladeren 84% van de invallende fotonen absorberen en dat 50% van deze fotonen door PSII worden geabsorbeerd; dit is echter niet altijd het geval (Baker, 2008). Dit kan leiden tot een overschatting van de elektronentransportsnelheid wanneer deze wordt berekend op basis van fluorescentie in vergelijking met metingen van GOP. Bovendien is een nauwkeurige bepaling van JA bijzonder relevant voor de schatting van de mesofylgeleiding, wat een toepassing was die door Gauthier et al. (2018) werd belicht. De Mehler-peroxidase-reacties, waarvan is aangetoond dat ze variëren van 0% tot 30% (Driever en Baker, 2011), zouden bij beide methoden leiden tot een overschatting van de elektronenfluxen die geassocieerd zijn met de fotosynthetische koolstofreductie/oxygenatiecycli. Het voordeel van de isotopenlabeling-benadering is echter dat de bijdrage van de Mehler-reactie aan de bruto O2-productie kan worden gekwantificeerd door metingen van GOP te koppelen aan NOP (bv. Furbank et al., 1982; zie Fig. 1). Nu we een hernieuwd vermogen hebben om O2-fluxen te meten, mogen deze veronderstellingen niet worden genegeerd.
Naast het begrijpen van de afweging tussen efficiëntie en fotoprotectie voor een verbeterde landbouwproductie (Murchie en Niyogi, 2011), hebben de verschillende elektron fates belangrijke implicaties voor het begrijpen van wereldwijde O2-fluxen. Met name O2 opname geassocieerd met fotorespiratie, mitochondriale ademhaling, en de Mehler-peroxidase reacties hebben verschillende isotopen fractioneringsfactoren (Guy et al., 1993), zodat de kwantificering van individuele pad fluxen nodig is om schattingen van de mondiale primaire productie te beperken uit δ18O informatie (Welp et al., 2011).
Het is hoog tijd dat we de meting van O2-fluxen opnieuw bekijken, en de nieuwe methode ontwikkeld door Gauthier et al. (2018) biedt ons de nodige capaciteit om dat te doen.