PMC

DNEs IN TRANSCRIPTIONAL VERORDENING

DNEs kunnen ook ontstaan in de context van transcriptionele regulatie. Een DNE kan bijvoorbeeld worden verkregen door het transactivatiedomein van een modulaire TF te verwijderen, waardoor alleen het DNA-bindingsdomein overblijft. Deze afgeknotte factor kan zich gedragen als een competitieve remmer van transcriptie. Het is bekend dat dit in de natuur voorkomt. Zo wordt het C/EBP-eiwit bij zoogdieren tot expressie gebracht in drie alternatieve polypeptiden. De langere polypeptiden bevatten een N-terminaal transcriptioneel activeringsdomein, terwijl de korte vorm dit domein ontbeert. Aangezien de lange en korte isovormen zich assembleren tot homo- en heterodimeren, gedraagt de laatste zich als een natuurlijke DN (Zahnow et al., 1997). Dit is ook het geval voor Stats 5 en 6 in vertebraten, die in staat zijn te dimeren. Hun proteolytische verwerking in reactie op fysiologische signalen leidt tot de verwijdering van het C-terminale activeringsdomein en verandert hen in krachtige remmers die de signaaltransductie negatief reguleren (Nakajima et al., 2003). In planten fungeren een groot aantal MYB-eiwitten als transcriptieregulatoren. In Arabidopsis zijn eiwitten met een enkele MYB DNA-bindende repeat, maar zonder het transactivatiedomein, betrokken bij het specificeren van aspecten van de epidermale celdeling. Deze eiwitten interageren met andere TF’s, waaronder bHLH-eiwitten, en door het ontbreken van een transactiveringsdomein gedragen ze zich als DN en trans-DN’s door inactieve complexen te vormen (Ramsay en Glover, 2005).

Verwijdering van het DNA-bindende domein kan ook leiden tot DNE’s. Dit gebeurt bij bHLH TF’s. Zoals hierboven vermeld, codeert het Id-1 gen voor een natuurlijk voorkomende DN remmer van deze familie van TF’s. Complete bHLH-eiwitten (met DNA-bindende en dimerisatiedomeinen) kunnen constitutief tot expressie worden gebracht. De gereguleerde expressie van Id-1, dat alleen het dimerisatiedomein bevat, legt echter regulatie op aan de bHLH-eiwitactiviteit (Sun, 1994). Een soortgelijk fenomeen wordt ook bij planten verwacht. Het genoom van Arabidopsis bijvoorbeeld codeert ∼120 bHLH-eiwitten waarvan voorspeld wordt dat ze DNA binden en 27 eiwitten met een minder basische regio dan vereist voor binding (Toledo-Ortiz et al., 2003). Deze niet-DNA bindende HLHs kunnen functioneren zoals dierlijke Id eiwitten, als negatieve regulatoren van bHLH eiwitten door de vorming van heterodimeren die geen DNA kunnen binden (Toledo-Ortiz et al., 2003). Vergelijkbare effecten worden verwacht bij TF’s die behoren tot de basic domain/leucine zipper (bZIP) familie, die een basaal DNA bindingsmotief, een leucine zipper dimerisatiedomein, en domeinen voor transactivatie bevatten. Arabidopsis codeert voor 67 bZIP-eiwitten, die alle naar verwachting als homo- en/of heterodimeren functioneren (Deppmann et al., 2004). Sommige van deze eiwitten zijn zeer klein en missen mogelijk activeringsdomeinen. In een klassiek voorbeeld in planten, hebben Fukazawa et al. (2000) de functie van de bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) in gibberelline signalering opgehelderd door het gebruik van een DN vorm van RSG, die een transcriptioneel activeringsdomein miste en daarom de functie van het wild-type eiwit represseerde wanneer het tot expressie werd gebracht in transgene tabak. Bovendien zijn, in overeenstemming met wat is gezegd in het gedeelte over trans-DN’s door overexpressie, DNA-eiwit transcriptiecomplexen ook gevoelig voor de balans tussen gen-dosering (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Veranderingen in dit evenwicht door verminderde of verhoogde expressie van een TF ten opzichte van andere die bij hetzelfde complex betrokken zijn, kunnen abnormale fenotypen induceren.

Een eenvoudig model van transcriptionele activering kan worden gebruikt om enkele kwantitatieve subtiliteiten van DN-mutaties in deze context te onderzoeken. Studies van virale systemen en Drosophila hebben aangetoond dat de transcriptie vaak een sigmoïdale relatie vertoont met betrekking tot de concentratie van een TF. In het geval van een systeem dat reageert op één type activator (A), kan deze sigmoïdale respons worden opgesplitst in twee hoofdcomponenten: coöperatieve binding van A aan de promotor (p) van een doelgen en synergie (figuur 6). Synergie is het resultaat van de gecoördineerde interacties tussen de reeds aan de promotor gebonden moleculen van A en de transcriptiemachine (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Beschouw een promotor, p, die twee bindingsplaatsen voor A bevat. Dezelfde bindingsplaatsen worden ook herkend door de variant a, die als een competitieve remmer zou kunnen werken. We nemen aan dat er sprake kan zijn van coöperativiteit tijdens de interactie tussen A-moleculen en de promoter. Dit zou ook het geval kunnen zijn voor de interacties tussen A, a, en de promoter. Een mogelijke bron van coöperativiteit werd hierboven genoemd (d.w.z. A heeft de neiging om in oplossing dimeren te vormen, maar dit wordt versterkt tijdens DNA-binding). Een andere mogelijkheid is dat monomeren niet in staat zijn tot interactie in oplossing en dat interactie van één monomeer met DNA leidt tot een allosterische verandering die de affiniteit van gebonden A voor een inkomend monomeer verhoogt. Het is ook mogelijk, hoewel minder waarschijnlijk, dat er geen A-A interacties zijn en dat binding van één monomeer aan DNA leidt tot een verandering in de naburige plaats die zijn affiniteit voor een nieuwkomer monomeer verhoogt. Hoe het ook zij, coöperativiteit betekent dat de reactie pA + A = pAA gemakkelijker optreedt dan p + A = pA.

Door het bestaan van synergie is de moleculaire soort die het meest bijdraagt aan transcriptie de promotor bezet door twee moleculen activator: pAA. Dit betekent ook dat als de affiniteitsconstante voor de associatie tussen het complex pA en het polymerase KpolA is, de K voor de associatie van pAA en het polymerase veel hoger zal zijn dan 2K (in de orde van K2polA; zie Zlotnick, 1994). Om in dit model rekening te houden met partiële transactivatie activiteit, zullen we Kpola (voor de reactie pa + pol) en Kpola2 (voor paa + pol) gebruiken. Onder deze veronderstellingen kan een vergelijking voor de transcriptionele respons (TR) als functie van de concentratie van A (en a) worden afgeleid, zoals beschreven door Veitia (2003) en Veitia en Nijhout (2006) (zie Supplemental Materials online).

Met een vrij eenvoudige vergelijking in de hand kunnen verschillende condities worden onderzocht: (1) de wild-type situatie A/A, (2) wanneer er een allel ontbreekt (A/-), en (3) wanneer er sprake is van coexpressie van A en een afgeknotte versie a die het transactivatiedomein mist. In het laatste geval kunnen we twee verschillende situaties onderscheiden: (3a) wanneer de mutatie van a de coöperativiteit opheft of (3b) wanneer A en a coöperatief interageren. Tenslotte kunnen we ook een situatie onderzoeken (4) waarin de transactiveringscapaciteit van a normaal is en de coöperativiteit afwezig, en (5) waarin de coöperativiteit normaal is maar de transactiveringscapaciteit gedeeltelijk.

Figuur 7 laat zien dat een TR, ten opzichte van de maximale output van de promotor, een sigmoïdaal verband vertoont, variërend tussen 0 en 1. Verzadiging weerspiegelt de maximale respons van het systeem, maar dit impliceert niet dat de promotor alleen bij verzadiging functioneert. Volgens de figuur, en in het algemeen, zijn de waarden op de curve voor de heterozygoot A/- op elk punt lager dan bij A/A (voor elke waarde van het relatieve , heeft de heterozygoot A/- in absolute termen twee maal minder dan het wilde type). Interessant is dat bij lage relatieve concentraties van A, de verschuiving tussen de curven zeer uitgesproken is Y(A/-) is ∼25% van Y(A/A). Zoals intuïtief te verwachten is, wordt echter voor hoge waarden van A ook verzadiging bereikt in A/-. Als dit systeem normaal functioneel zou zijn bij lage concentraties van A, zou een individu met A/- een typisch haploinsufficient fenotype vertonen.

Wat gebeurt er in A/a als a het transactivatiedomein mist in afwezigheid van coöperativiteit? Volgens de klassieke DN-definitie is de curve op elk punt lager dan die van A/-. Er is echter een tendens om verzadiging te bereiken met toenemende concentraties van A en a. In feite heeft A de neiging om bij voorkeur de promotor te bezetten, aangezien dit zorgt voor coöperatieve interacties met inkomende A-monomeren. Het is echter duidelijk dat promoterherkenning bij lage eiwitconcentraties minder gemakkelijk optreedt bij A/a dan in de wild-type conditie. In de praktijk zal een afgeknot monomeer dat niet voor coöperatieve interacties kan zorgen, leiden tot een zwakke DNE. De situatie is totaal anders aan het andere uiterste, wanneer de coöperativiteit tussen A en a volledig gehandhaafd blijft. Het plateau van de curve voor A/a wordt namelijk bereikt bij TR = 0,25. Dit wordt verwacht omdat pAA, dat de transcriptie aandrijft (d.w.z. de bijdragen van pAa en paa zijn verwaarloosbaar), slechts 25% van de bezette promotorsoorten vertegenwoordigt bij verzadiging.

Een mogelijk voorbeeld wordt geleverd door een kunstmatige mutatie in de TF FOXL2. Deze TF onderdrukt de promotor van het menselijke steroidogene acute regulatiegen, dat meerdere vermoedelijke bindingsplaatsen bevat. Een versie van FOXL2 die het DNA-bindende domein bevat maar het C-terminale domein mist, is in staat een DNE te induceren die de transcriptionele repressie belemmert. Dit effect wordt echter alleen verkregen wanneer de DN-versie veel sterker tot expressie komt (5× en 10×) dan het wild-type eiwit (Pisarska et al., 2004). Zoals hierboven geschetst, kan dit het gevolg zijn van het ontbreken van coöperatieve interacties tussen FOXL2 moleculen op deze promoter.

Een sprekender voorbeeld wordt gegeven in figuur 8, die de respons weergeeft van twee verschillende promotors die een of twee bindingsplaatsen bevatten voor de TF PTX2a en zijn DN versie, zoals eerder beschreven (Saadi et al., 2003. Bij lage hoeveelheden transfecteren DNA (0,05 ug in figuur 8), de respons van de promotor met twee sites is meer dan twee keer sterker (dat wil zeggen, 3 ×) dan de respons van de promotor met slechts een site. Dit is de gecombineerde signatuur van coöperativiteit en synergie. Bovendien, bij hoge concentraties van de transfecterende constructen WT + DN, de TR van de promotor met twee bindingsplaatsen is ∼25% van de respons van het wilde type alleen. Dit is te verwachten omdat bij hoge eiwitconcentraties dimeren kunnen worden voorgeassembleerd nog voordat ze het doel-DNA bereiken. In dit geval zal slechts 25% van de dimeren normaal zijn. De daling van TR is minder dramatisch voor de promotor met slechts één bindingsplaats (naar verwachting 50%). Vanuit een praktisch oogpunt, om te voorkomen dat over het hoofd zien een potentiële DNE in vitro experimenten, moeten lage hoeveelheden van de WT + DN constructen worden getransfecteerd met een overmaat van reporter promotor om te voorkomen dat de verzadiging door de wild-type vorm. Meer in het algemeen moeten responscurven voor verschillende TF-concentraties voor dergelijke transfectie-experimenten worden verstrekt.