How Does Flow Cytometry Work?

Laten we eerst eens inzoomen op de basisprincipes van flowcytometrie

Wat is flowcytometrie?

Flow Cytometry is een techniek die wordt gebruikt voor het opsporen en meten van fysische en chemische kenmerken van een populatie cellen of deeltjes. Hierbij wordt een monster dat cellen of deeltjes bevat, in een vloeistof gesuspendeerd en in het flowcytometer-instrument geïnjecteerd.

Wat is het doel van flowcytometrie?

Flowcytometrie is een beproefde methode om cellen in oplossing te identificeren en wordt het meest gebruikt voor de evaluatie van perifeer bloed, beenmerg, en andere lichaamsvloeistoffen. Flowcytometrische studies worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van immuuncellen en het karakteriseren van hematologische maligniteiten.1 Ze kunnen meten:

• celgrootte
• celgranulariteit
• totaal DNA
• nieuw gesynthetiseerd
• DNA genexpressie
• surface receptoren
• intracellulaire proteïnen
• transient signaal

De mogelijkheid om deze metingen in een zeer korte tijdspanne uit te voeren is een van de belangrijkste voordelen van het flowcytometrische proces. Zij kunnen tot drie tot zes eigenschappen of componenten worden gekwantificeerd in één enkel monster, cel voor cel, voor ongeveer 10.000 cellen, in minder dan één minuut.

Stroomcytometrie-instrumentatie en -methodologie

Stroomcytometers nemen een suspensie van monodisperse afzonderlijke, niet-geklonterde cellen en laten deze één voor één (single file) langs een laserstraal lopen, waarbij elke cel door de laserstraal, het verstrooide en fluorescerende licht passeert en vervolgens wordt geteld en gesorteerd of verder gekarakteriseerd.

De drie hoofdcomponenten van een flowcytometer zijn de fluïdica, de optica en de elektronica.

• Het fluïdica-systeem van een flowcytometer is verantwoordelijk voor het transport van monsters van de monsterbuis naar de flowcel, langs de laser, gesorteerd en/of weggegooid.
• De componenten van het optische systeem omvatten excitatielichtbronnen, lenzen en optische filters die worden gebruikt om golflengten van licht te verzamelen en te verplaatsen rond het instrument en het detectiesysteem dat de fotostroom genereert. Het verschil in golflengte-respons in de gegevens helpt celtype te analyseren.
• De elektronica of flowcytometer-instrumentatie.

Een van de belangrijkste principes van het gebruik van flowcytometrie is de mogelijkheid om de volledige celcyclus te analyseren en de DNA-inhoud in verschillende fasen te analyseren. Het volgen van de natuurlijke gebeurtenissen van de celcyclus kan informatie opleveren voor ziektediagnose en therapieprognose. De verschillende fasen van de celcyclus kunnen een gewijzigd DNA-gehalte en andere afwijkingen aan het licht brengen die wijzen op de aanwezigheid van tumoren of tekenen van gevorderde celdood. De gegevensuitdrukkingen worden in een computer opgeslagen via gespecialiseerde flowcytometriesoftware die gekoppeld is aan het gekozen instrumentgebruik op het moment van de analyse. Flowcytometriegegevens worden gewoonlijk op twee verschillende manieren gerapporteerd: een histogram en/of een dot plot2.

G1-fase:	RNA, ribosomen en eiwitten worden gesynthetiseerd
S-fase:	DNA wordt gerepliceerd
G2-fase:	Verschijnt de fase tussen DNA-synthese en mitose
M-fase:	cellen worden verdeeld in twee dochtercellen

FACS

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een gespecialiseerd type van flowcytometrie. Het is een methode voor het sorteren van een heterogeen mengsel van biologische cellen in twee of meer containers, één cel per keer, op basis van de specifieke lichtverstrooiing en fluorescerende kenmerken van elke cel. Het verschilt van flowcytometrie in de zin dat het een unieke karakterisering oplevert tegenover het louter tellen en sorteren van cellen. Het is gebruikelijk dat de twee principes werken in een co-characterization type proces om een volledige kwalitatieve en kwantitatieve benadering van flowcytometrische analyse aan te bieden.

Het Flow Cytometrische Proces:

De celsuspensie wordt opgenomen in het midden van een smalle, snelstromende vloeistofstroom. De stroom is zo ingericht dat er een grote scheiding is tussen de cellen in verhouding tot hun diameter. Een trilmechanisme dwingt de stroom cellen in afzonderlijke druppeltjes te breken. Het systeem is zo afgesteld dat er een kleine kans is op meer dan één cel per druppel. Net voordat de stroom in druppeltjes uiteenvalt, passeert de stroom een fluorescentie-meetstation waar het fluorescerende karakter van belang van elke cel wordt gemeten.

Een elektrische oplaadring wordt geplaatst juist op het punt waar de stroom in druppels breekt. Een lading wordt geplaatst op de ring op basis van de onmiddellijk voorafgaande fluorescentie-intensiteitsmeting, en de tegenovergestelde lading wordt gevangen op de druppel wanneer deze uit de stroom breekt. De geladen druppels vallen dan door een elektrostatisch afbuigsysteem dat druppels afleidt in containers op basis van hun lading. In sommige systemen wordt de lading rechtstreeks op de stroom aangebracht, en de druppel die afbreekt behoudt een lading van hetzelfde teken als de stroom. De stroom wordt dan weer neutraal nadat de druppel is afgebroken.

Een antilichaam dat specifiek is voor een bepaald celoppervlak-eiwit wordt geassocieerd met een fluorescerende molecule en vervolgens toegevoegd aan een mengsel van cellen. Vervolgens wordt fluorescentie toegepast, waarbij specifieke cellen door een laserstraal worden gevolgd. Druppels die één enkele cel bevatten, krijgen een positieve of negatieve lading toegewezen, afhankelijk van het feit of de cel een fluorescent gemerkt antilichaam heeft. Druppels die een enkele cel bevatten, worden vervolgens gedetecteerd door een elektrisch veld en op basis van hun lading naar afzonderlijke verzamelbuisjes geleid, zodat de cellen die zijn gemarkeerd met het fluorescerende antilichaam, gemakkelijk kunnen worden gescheiden.

Multicolor flowcytometrie

Multicolor flowcytometrie is een nuttige techniek bij het onderzoek van gemengde celpopulaties, zoals bloed- en weefselcellen in menselijke en dierlijke monsters. In het algemeen wordt een specifiek celtype gemarkeerd met een fluorescerende kleurstof (markers) zoals fluorofoor of propidiumjodide. De mogelijkheid om meerdere fluorescente markers tegelijk te gebruiken maakt de identificatie van meerdere celtypes mogelijk, evenals functionele markers die elk monster verder karakteriseren. Er zijn gespecialiseerde instrumenten waarmee 12 of meer kleuren kunnen worden gemeten 3,4 . Deze fluorescente kleurstoffen en markers worden gemeten door verschillende golflengten van het door de laser uitgezonden licht om te sorteren op individueel celtype. Elke marker wordt geëxciteerd bij een specifieke golflengte van licht om ze te onderscheiden bij gebruik van meerdere markers.

Het aanpassen van een typisch kleuringpaneel van 4 tot 6 kleuren tot meer dan 12 kleuren is niet gewoon een kwestie van “plug and play”, het moet op een systematische manier worden benaderd om succesvolle parameters in een kleuringpaneel te bereiken. De basisprincipes van het paneelontwerp werken het best op basis van onderzoek voorafgaand aan het gebruik. Met andere woorden, voorbereiding is de sleutel, zelfs vanaf het beginproces van het verwijzen naar de vlekkenindex met betrekking tot het effectief matchen van fluorochromen door helderheid5.

Flow Cytometry Tip:

Stook wat tijd in om de subtiele nuances van uw flowcytometer te begrijpen voordat u uw primaire antilichaampanel ontwerpt. Focus op waar de meest gevoelige metingen kunnen worden gedaan op het systeem. Er is meer dan alleen fluorescentie-intensiteit.

Overweeg vervanging door een minder helder fluorochroom om kanaalfouten te voorkomen.

Common Applications of Flow Cytometry Methodology

Flow cytometry is een integraal onderdeel in verschillende klinische gebieden, met inbegrip van diagnose, behandelingsplannen, en systemische ziekte of statisch of progressief. Naarmate we meer te weten komen over de praktische toepassingen voor het gebruik van flowcytometrie, wordt de kennisbasis verder uitgebreid. Onderzoekers zijn nu meer dan ooit zeer enthousiast over de mogelijkheid om meer te weten te komen over de complexiteit van bepaalde ziekten en aandoeningen. Het heeft geleid tot een snelle verandering in het diagnosticeren van patronen en drastisch veranderde medische benaderingen voor de behandeling van ziekten zoals kanker6.

Flowcytometrie-methodologie wordt vaak betrokken bij andere uitgebreide testpatronen zoals morfologisch onderzoek. In veel gevallen vertonen hematologische neoplasma’s specifieke morfologische veranderingen, en flowcytometrie biedt een grotere specificiteit en helpt pathologen om weefselanomalieën of andere gevorderde ziekte te verduidelijken. Flowcytometrie, in sommige gevallen, kan vooraf de terugkeer van kanker bepalen voordat morfologische veranderingen worden gedetecteerd7.

Een paar van de belangrijkste toepassingen die worden gebruikt in het kader van de moderne klinische settings zowel therapeutisch als onderzoek georiënteerd omvatten:

• Proteïne-expressie-door de gehele cel, zelfs de kern
• Proteïne post translationele modificaties-omvat gespleten en gefosforyleerde eiwitten
• RNA-omvat zowel miRNA, en mRNA-transcripten
• Celgezondheidsstatus-detectie van apoptotische cellen of celdood
• Celcyclusstatus-biedt een krachtig hulpmiddel om cellen in G0/G1-fase versus S-fase, G2, of polyploïdie te beoordelen, inclusief analyse van celproliferatie en activatie
• Identificatie en karakterisering van verschillende subsets van cellen binnen een heterogeen monster – inclusief het onderscheiden van centrale effector-geheugencellen van uitgeputte T-cellen of regulatoire T-cellen

Wrapping Up

De basisprincipes van flowcytometrie zijn weinig veranderd in de afgelopen tien jaar, maar de toepassingen van deze technologie hebben een grote ontwikkeling doorgemaakt. De grondslagen van flowcytometrie zijn consistent geweest met zijn primaire functie, namelijk het ondervragen van individuele cellen of deeltjes in een stroom met een laser terwijl de cellen langs een reeks stationaire detectoren bewegen. In toenemende mate worden meer kleuren fluorescentie gedetecteerd door cytometers, naast sorteren met hoge snelheid en een analytische functie8.

Flowcytometrie speelt een integrale rol in moleculair-wetenschappelijk onderzoek en blijft zich in hoog tempo ontwikkelen. Er zijn verschillende commerciële flowcytometers op de markt. Zij hebben de neiging volgens hetzelfde basisprincipe te werken, maar er zijn belangrijke verschillen in hun ontwerp, en concepten over uitlijning en integratie van andere componenten.

Aan de horizon zal een 3D-instrumentatie worden geïntroduceerd en opgenomen in een hybride eigen instrument van NanoCellect Biomedical, de WOLF Cell Sorter. We kunnen ook uitkijken naar de ontwikkeling van smal spectrum fluorescerende probes, de integratie van moleculair biologische technieken met flowcytometrie, en de evaluatie van celvrije markers zoals cytokines zullen belangrijke componenten zijn in de voortdurende evolutie van flowcytometrie analyse en cel assay technology.

Bronnen:

1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221

2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/

3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959

4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26

5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250

6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/

7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/

8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543