De onderdelen van een eenvoudig vloeistofchromatografiesysteem met hoge prestaties zijn weergegeven in het eenvoudige schema in figuur E.
Een reservoir bevat het oplosmiddel. Een hogedrukpomp wordt gebruikt om een gespecificeerde stroomsnelheid van de mobiele fase, meestal milliliters per minuut, te genereren en te meten. Een injector kan het monster inbrengen in de continu stromende stroom mobiele fase die het monster naar de HPLC-kolom voert. De kolom bevat het chromatografische pakkingsmateriaal dat nodig is om de scheiding tot stand te brengen. Dit verpakkingsmateriaal wordt de stationaire fase genoemd omdat het op zijn plaats wordt gehouden door de kolomhardware. Er is een detector nodig om de gescheiden samenstellingsbanden te zien wanneer zij uit de HPLC-kolom elueren. De mobiele fase verlaat de detector en kan naar keuze naar het afval worden afgevoerd of worden opgevangen. Wanneer de mobiele fase een afgescheiden band bevat, biedt HPLC de mogelijkheid om deze fractie van het eluaat met de gezuiverde verbinding op te vangen voor verder onderzoek. Dit wordt preparatieve chromatografie genoemd.
Merk op dat hogedrukbuizen en -fittingen worden gebruikt om de pomp, de injector, de kolom en de detector met elkaar te verbinden en zo de mobiele fase, het monster en de gescheiden verbindingen te geleiden.
Figuur E: Vloeistofchromatografiesysteem met hoge prestaties
De detector is verbonden met het computer datastation, de component van het HPLC-systeem die het elektrische signaal registreert dat nodig is om het chromatogram op het scherm te genereren en om de concentratie van de bestanddelen van het monster te identificeren en te kwantificeren (zie figuur F). Aangezien de kenmerken van monsterverbindingen zeer verschillend kunnen zijn, zijn er verschillende soorten detectoren ontwikkeld. Als een verbinding bijvoorbeeld ultraviolet licht kan absorberen, wordt een UV-absorptiedetector gebruikt. Als de verbinding fluoresceert, wordt een fluorescentiedetector gebruikt. Indien de verbinding geen van deze kenmerken heeft, wordt een meer universeel type detector gebruikt, zoals een verdampings-lichtverstrooiingsdetector. De krachtigste aanpak is het gebruik van meerdere detectoren in serie. Zo kan bijvoorbeeld een UV- en/of ELSD-detector worden gebruikt in combinatie met een massaspectrometer om de resultaten van de chromatografische scheiding te analyseren. Hierdoor kan met één injectie uitgebreidere informatie over een analyt worden verkregen. De koppeling van een massaspectrometer aan een HPLC-systeem wordt LC/MS genoemd.
Figuur F: Een typisch HPLC-systeem
HPLC-werking
Een eenvoudige manier om te begrijpen hoe we de scheiding van de verbindingen in een monster tot stand brengen, is het diagram in figuur G te bekijken.
Mobiele fase komt de kolom van links binnen, gaat door het deeltjesbed, en verlaat de kolom aan de rechterkant. De stroomrichting wordt weergegeven door groene pijlen. Beschouw eerst het bovenste beeld; dit geeft de kolom op het tijdstip nul weer, wanneer het monster de kolom binnenkomt en een band begint te vormen. Het hier getoonde monster, een mengsel van gele, rode en blauwe kleurstoffen, verschijnt aan de inlaat van de kolom als een enkele zwarte band.
Na enkele minuten, waarin de mobiele fase continu en gestaag langs de pakkingdeeltjes stroomt, is te zien dat de afzonderlijke kleurstoffen zich in afzonderlijke banden met verschillende snelheden hebben verplaatst. Dit komt doordat er een competitie is tussen de mobiele fase en de stationaire fase voor het aantrekken van elk van de kleurstoffen of analyten. De band met de gele kleurstof beweegt het snelst en staat op het punt de kolom te verlaten. De gele kleurstof houdt meer van de mobiele fase dan de andere kleurstoffen. Daarom beweegt hij met een hogere snelheid, dichter bij die van de mobiele fase. De blauwe kleurstof houdt meer van het verpakkingsmateriaal dan van de mobiele fase. Zijn sterkere aantrekkingskracht op de deeltjes zorgt ervoor dat hij aanzienlijk langzamer beweegt. Met andere woorden, het is de meest vastgehouden verbinding in dit monstermengsel. De rode kleurstof heeft een gemiddelde aantrekkingskracht op de mobiele fase en beweegt daarom met een gemiddelde snelheid door de kolom. Aangezien elke kleurstofband met een andere snelheid beweegt, kunnen we hem chromatografisch scheiden.
Figuur G: Begrijpen hoe een chromatografische kolom werkt – Banden
Wat is een detector?
Als de gescheiden kleurstofbanden de kolom verlaten, gaan ze onmiddellijk de detector in. De detector bevat een stroomcel die elke afgescheiden samengestelde band ziet tegen een achtergrond van mobiele fase. Een geschikte detector is in staat de aanwezigheid van een verbinding waar te nemen en het overeenkomstige elektrische signaal naar een computer datastation te zenden. Er wordt een keuze gemaakt uit vele verschillende soorten detectoren, afhankelijk van de kenmerken en concentraties van de verbindingen die moeten worden gescheiden en geanalyseerd, zoals eerder besproken.
Wat is een chromatogram?
Een chromatogram is een weergave van de scheiding die chemisch heeft plaatsgevonden in het HPLC-systeem. Op een tijdas wordt een reeks pieken getekend die vanaf een basislijn stijgen. Elke piek vertegenwoordigt de detectorrespons voor een verschillende verbinding. Het chromatogram wordt door het computer datastation uitgezet.
Figuur H: Hoe pieken tot stand komen
In figuur H is de gele band volledig door de stroomcel van de detector gegaan; het opgewekte elektrische signaal is naar het computer datastation gestuurd. Het resulterende chromatogram begint op het scherm te verschijnen. Merk op dat het chromatogram begint wanneer het monster voor het eerst werd geïnjecteerd en begint als een rechte lijn die zich dicht bij de onderkant van het scherm bevindt. Dit wordt de basislijn genoemd; dit is de zuivere mobiele fase die in de loop van de tijd door de flowcel stroomt. Naarmate de gele analytband door de flowcel passeert, wordt een sterker signaal naar de computer gezonden. De lijn buigt, eerst naar boven en dan naar beneden, in verhouding tot de concentratie van de gele kleurstof in de monsterband. Hierdoor ontstaat een piek in het chromatogram. Nadat de gele band de detectorcel volledig is gepasseerd, keert het signaalniveau terug naar de basislijn; de flowcel bevat nu weer uitsluitend zuivere mobiele fase. Aangezien de gele band het snelst beweegt en het eerst uit de kolom elueert, is dit de eerste afgetekende piek.
Na enige tijd bereikt de rode band de doorstroomcel. Het signaal stijgt ten opzichte van de basislijn wanneer de rode band voor het eerst de cel binnenkomt, en de piek die de rode band vertegenwoordigt begint te worden afgetekend. In dit diagram is de rode band nog niet volledig door de doorstroomcel gegaan. Het diagram toont hoe de rode band en de rode piek eruit zouden zien als we het proces op dit moment zouden stoppen. Aangezien het grootste deel van de rode band door de cel is gegaan, is het grootste deel van de piek al getrokken, zoals de ononderbroken lijn laat zien. Als we opnieuw zouden kunnen beginnen, zou de rode band volledig door de flowcel passeren en zou de rode piek voltooid zijn. De blauwe band, die het sterkst vastgehouden wordt, gaat het traagst en elueert na de rode band. De stippellijn laat zien hoe het chromatogram er zou uitzien als we de reeks tot het einde hadden laten doorlopen. Het is interessant op te merken dat de breedte van de blauwe piek het breedst zal zijn, omdat de breedte van de blauwe analytband, die op de kolom het smalst is, het breedst wordt wanneer de analyt uit de kolom elueert. Dit komt doordat de analyt langzamer door het bed van het chromatografische pakkingsmateriaal beweegt en meer tijd nodig heeft om volledig te worden geëlueerd. Aangezien de mobiele fase continu met een vaste snelheid stroomt, betekent dit dat de blauwe band breder wordt en meer verdund is. Aangezien de detector reageert in verhouding tot de concentratie van de band, is de blauwe piek lager in hoogte, maar groter in breedte.